一種二維毛細管電泳裝置及其應用的製作方法

2023-08-04 14:30:31

專利名稱：一種二維毛細管電泳裝置及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及二維毛細管電泳裝置，具體地說是一種新型二維毛細管電
泳(2D-CE)分離裝置及其應用。
背景技術：
毛細管電泳(CE)具有分離效率高、分析速度快和樣品用量少等優點。 但是常規的CE方法，由於受到應用電壓的限制，所採用分離柱的長度有限， 進而影響了實際柱效和可能達到的峰容量。此外，由於毛細管的光程短， 所以CE的檢測靈敏度較低。這些缺點都限制了 CE在複雜生物樣品分析中 的應用。因此，通過選擇正交的CE模式，發展具有高峰容量和高檢測靈敏 度的2D-CE具有重要意義。
目前，2D-CE在分離蛋白質方面已有諸多報導[文獻1: Michels， D. A.; Hu, S.; Schoenherr, R. M.; Eggertson, M. J.; Dovichi, N. J. Mol. Cell. Proteomics 2002, 7, 69-74. 文獻2: S. Hu, D. Michels， M.A. Fazal, C. Ratisoontom, M丄.Cunningham, N.J. Dovichi, Anal. Chem.,2004, 76, 4044-4049. 文獻3: Sheng, L.; Pawliszyn， J. Analyst 2002, 127, 1159-1163.]。 由於C正F具有較強的富集能力(Shen, Y.等[文獻4: Shen， Y.; Berger, S. J.; Anderson, G. A.; Smith, R. D. Anal. Chem. 2000, 72， 2154-2159.]報導C正F的 富集倍數高達540倍)，是2D-CE的最佳第一維分離模式。目前已被用於 CIEF-CZE分離核糖核酸酶[文獻5: C. Yang， L. Zhang， H. Liu, W. Zhang， Y. Zhang, J.Chromatog.A, 2003， 1018， 97—103.]和肌紅蛋白、血紅蛋白的混合 物[文獻6: H. Liu, L. Zhang, G. Zhu, W. Zhang, and Y. Zhang, Anal. Chem. 2004,76,6506-6512.]、 CIEF-CGE分離血紅蛋白[文獻7: C. Yang, H. Liu, Q. Yang, L. Zhang, W. Zhang, and Y. Zhang, Anal. Chem. 2003, 75, 215-218.]、 C正F-CNGSE分離小鼠肺癌細胞的分泌蛋白提取物[文獻8: H. Liu, C. Yang, Q. Yang, W. Zhang, Y. Zhang, J. Chromatogr. B, 2005, 817 , 119—126.]、 CIEF-CITP/CZE分離細胞色素C、核糖核酸酶A和碳酸酐酶的酶解產物[文獻 9 : Mohan, D., Lee, C. S., Electrophoresis 2002, 23, 3160—3167.]、 CIEF-HFF1FFF分離人的尿蛋白[文獻10: Dukjin Kang and Myeong Hee Moon, Anal. Chem. 2006, 78, 5789-5798.]和CIEF-CEC分離去除白蛋白的人血清[文 獻l 1: M. Zhang and Rassi Z. E.， J. Proteome Res., 2006, 5, 2001-2008.] 。 CIEF 使用的兩性電解質不僅具有較高的緩衝能力，並且有助於建立穩定的pH梯 度。然而，兩性電解質在低紫外波長處吸收較強，會降低樣品的檢測靈敏 度。儘管在上述構建的二維系統中均有去除兩性電解質的接口，但是去除 效果不是很完全，會影響後續的分離檢測。ChunYang等[文獻12: C.Yang,G. Zhu， L. Zhang, W. Zhang, Y. Zhang, Electrophoresis 2004, 25， 1729—1734.]
通過將兩性電解質共價鍵合到毛細管整體柱中形成固定化pH梯度可以有效 地解決上述問題，但尚未用於2D-CE的構建。

發明內容
本發明的目的在於提供一種可顯著提高蛋白質分離能力的二維毛細管 電泳(2D-CE)分離裝置(圖1)及其應用；利用該裝置，第一維使用固定 化pH梯度毛細管整體(M-IPG)柱不僅可以起到富集分離樣品的作用，而 且在緩衝液中不用添加兩性電解質，避免了對第二維分離的幹擾。此外， 採用2D-CE的分離模式，可以顯著提高系統的峰容量，從而滿足複雜生物 樣品的分析需要。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為
一種二維毛細管電泳裝置，可用於蛋白質樣品的分離，包括一個2D-CE 接口； 一根固定化pH梯度毛細管整體(M-IPG)柱作為2D-CE的第一維 分離柱，其出口端通過連接管與2D-CE接口的一端相連，其進樣端置於裝 有鹼性緩衝液的入口貯槽中或與一個注射泵相連； 一根毛細管作為2D-CE 的第二維分離柱，其進樣端通過連接管與2D-CE接口的另一端相連，其出 口端置於裝有酸性緩衝液的貯槽中；2D-CE接口置於裝有酸性緩衝液貯槽 中。
所述2D-CE接口為聚四氟乙烯接口、膜接口和毛細管刻蝕接口；固定 化pH梯度整體柱的內徑可以為100 jim 250 (am，長度為10 40 cm;第 二維分離柱毛細管的內徑為50或75 |im，長度為10 50 cm;所述第二維 分離柱毛細管為內壁塗層毛細管或者非塗層毛細管。
應用本發明時，在第一維毛細管等電聚焦(CIEF)分離完成後，生物 大分子組分流經接口分段地進入第二維毛細管進行分離，實現2D-CE。由 於該二維系統採用M-IPG柱作為第一維，不僅可以起到富集分離樣品的作 用，而且在緩衝液中不用添加兩性電解質，避免了對第二維分離的幹擾。 此外，由於該柱可產生較大的反壓，需要採用恆流泵為系統提供驅動力。 當生物大分子組分流經接口時，在較大驅動力存在的情況下不會向接口外 擴散，因此不會引起樣品的損失和稀釋。
具體的操作如下
在聚焦前，首先將蛋白質樣品溶液灌滿第一維分離柱(D);
1) 在聚焦時，第一維分離柱的進樣端置於裝有鹼性緩衝液的入口lt槽 中，2D-CE接口置於酸性緩衝液貯槽中，第二維分離柱出口端與一裝有酸 性緩衝液的出口貯槽相連接； 一臺工作高壓直流電源的地線插入2D-CE接 口處的貯槽中，負極插入第一維分離柱進樣端入口貯槽中；入口貯槽中加 負高壓，2D-CE接口處接地，蛋白質樣品在第一維分離柱屮聚焦；
2) 在分離時，將第一維分離柱從入口貯槽中取出，第一維分離柱的進 樣端與一個注射泵相連，其他連接方式不變；在不加電的情況下用注射泵將第一維聚焦的組分區帶分段送入第二維分離柱中；
3)待樣品組分進入第二維時，停止注射泵， 一臺工作高壓直流電源的
地線插入2D-CE接口處的酸性緩衝液貯槽中和注射泵處，負極插入第二維分離柱出口端緩衝液的出口貯槽中；出口貯槽加負高壓，2D-CE接口和注射泵處接地，進行蛋白質樣品的2D-CE分離。
所述第二維分離柱的分離模式可以為毛細管區帶電泳、毛細管膠束電動色譜、毛細管凝膠電泳或者毛細管電色譜；恆流泵的流速可以為0.25 1.0 (Al/min;所述直流電源於第一維或第二維分離柱施加的電壓為5 20kV。
所述鹼性緩衝可以為PH>10的氫氧化鈉水溶液或者氨水；酸性緩衝可以為PH<3.5甲酸、磷酸或者穀氨酸水溶液；本發明具有如下優點
1、 具有不同CE模式聯用的特點。本發明可通過在2D-CE接口處向分離系統中添加小分子(包括酸、鹼或鹽)等，實現不同CE模式的組合，即構建多種2D-CE分離模式。
2、 接口簡單。本發明採用的M-IPG柱解決了在緩衝溶液中添加兩性載體帶來的幹擾問題，降低了對接口置換能力的要求，使接口製作簡單，容易實現。
3、 檢測靈敏度高。本發明採用M-IPG柱，可有效避免兩性電解質對214 nm波長下進行紫外檢測的幹擾；此外，M-IPG-C正F本身具有樣品富集作用。因此，該系統具有較高的檢測靈敏度。
4、 峰容量高。在分離模式正交的情況下，2D-CE系統的峰容量應該為每一維峰容量的乘積。因此，該系統具有較高的分離能力，可滿足複雜樣品的分離需要。


圖1為本發明的固定化pH梯度整體柱等電聚焦一毛細管區帶電泳(2D-M-IPG-CIEF-CZE)分離平臺結構示意圖，(1)聚焦時，(2)分離時；圖2為本發明一個實施例中7個標準蛋白的一維分離譜圖，A: CZE譜
圖；B: M-IPG-CIEF譜圖3為本發明一個實施例中7個標準蛋白的固2D-M-IPG-CIEF-CZE分
離譜圖；各圖的標號為所處的組分數；
圖4為本發明一個實施例中7個標準蛋白的二維投影圖5為本發明一個實施例中牛奶蛋白的一維分離譜圖6為本發明一個實施例中牛奶蛋白的2D-M-IPG-CIEF-CZE分離譜
圖；各圖的標號為所處的組分數；
圖7為本發明一個實施例中牛奶蛋白的二維投影圖。
具體實施例方式
一種二維毛細管電泳裝置，可用於蛋白質樣品的分離，包括一個2D-CE接口；
一根固定化pH梯度毛細管整體柱作為2D-CE的第一維分離柱，其出口端通過連接管與2D-CE接口的一端相連，其進樣端置於裝有鹼性緩衝液的入口貯槽中或與一個注射泵相連；
一根毛細管作為2D-CE的第二維分離柱，其進樣端通過連接管與2D-CE接口的另一端相連，其出口端置於裝有酸性緩衝液的貯槽中；
2D-CE接口置於裝有酸性緩衝液貯槽中。
所述2D-CE接口為聚四氟乙烯接口 。
如圖l所示，具體操作過程為
在聚焦前，首先將蛋白質樣品溶液灌滿第一維分離柱(D);
1) 在聚焦時，第一維分離柱D的進樣端置於裝有鹼性緩衝液的入口貯槽A中，2D-CE接口B置於酸性緩衝液貯槽中，第二維分離柱G出口端與一裝有酸性緩衝液的出口貯槽C相連接； 一臺工作高壓直流電源I的地線插入2D-CE接口 B處的貯槽中，負極插入第一維分離柱D進樣端入口貯槽A中；在入口貯槽A處加負高壓，2D-CE接口B處接地，蛋白質樣品在第一維分離柱(D)中聚焦；
2) 在分離時，將第一維分離柱D從入口貯槽A中取出，第一維分離柱D的進樣端與一個注射泵J相連，其他連接方式不變；在不加電的情況
下用注射泵J將第一維聚焦的組分區帶分段送入第二維分離柱G中；
3) 待樣品組分進入第二維時，停止注射泵J， 一臺工作高壓直流電源I的地線插入2D-CE接口 B處的酸性緩衝液貯槽中和注射泵J處，負極插入第二維分離柱G出口端緩衝液的出口貯槽C中；出口貯槽C加負高壓，注射泵J和2D-CE接口 B處接地，進行蛋白質樣品的2D-CE分離。
其中E為聚四氟乙烯連接管，F為連接毛細管，H為檢測窗口；實施例1 一 一
如圖1所示，第一維採用M-IPG CIEF的方法，正極緩衝液為20 mmol/L穀氨酸，負極緩衝液為j0mmol/LNaOH。將樣品充滿整個M-IPG柱，整體柱長20cm (本發明中釆用過的長度為15， 20， 30禾Q40cm)，內徑100)im(可以為100， 200和250 pm)。第二維採用CZE分離，分離緩衝為20 mmol/L穀氨酸，毛細管總長為30cm (本發明中採用的過長度為20和30cm)，有效長為20cm (本發明中採用的過長度為10和20cm)，內徑50iLim (可以為75拜)。
樣品為7種標準蛋白的混合液分別為胰蛋白酶抑制劑(trypsininhibitor, pi 4.5)、牛血清白蛋白(BSA， pi 4.8)、白蛋白(albumin, pi 4.9)、卩-乳球蛋白(卩-lactoglobulin， pi 5.0)、血紅蛋白(Hemoglobin, pi 7.1)、尿素酶(urease, pi 9.0)和核糖核酸酶A (Ribonuclease A， pi 9.5)。樣品溶於10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，各標準蛋白濃度相同，總濃度為0.033mg/mL。在聚焦前，首先將蛋白質樣品溶液灌滿第一維分離柱(D);
一在第一維M-IPG-CIEF分離時給第一維毛細管柱上施加14 kV (本發明 中採用的過的電壓為12、 14和16 kV)電壓。聚焦完成後，固定化pH梯 度整體柱(D)從裝有鹼性緩衝液的入口貯槽(A)中取出，接上恆流泵(J)， 緩衝液貯槽(C)加負高壓，恆流泵和二維毛細管電泳接口 (B)中接地， 恆流泵(J)，將第一維聚焦的組分分段地送入第二維分離毛細管(G)，此 時不加電。待樣品組分進入第二維時，停止恆流泵(J)，第二維施加電壓， 進行二維分離，;到第一維組分輸送完全。具體操作是恆流泵流速0.5 ^L/min (本發明採用過的流速為0.2， 0.3， 0.5和1.0 |uL/min)，輸送1.5min (本發明採用過的時間0.5， 1， 1.5禾P2min)。將第一維的一段樣品區帶送 入第二維，這相當於進樣過程，然後停泵，第二維施加電壓14kV，分離時 間為8min。如此循環，直到第一維組分輸送完全，第二維不出峰為止，從 而實現2D-M-IPG-CIEF-CZE分離。 一共切換了22個組分，平均峰寬0.063 min，分離時間8min，峰容量2794。
如圖2A所示，採用CZE方式，7個標準蛋白只分成了兩個峰，分離效 果較差；如圖2B所示，M-IPG-CIEF分離了大約7個小峰，但分離度較小， 沒有實現基線分離。如圖3所示，採用2D-M-IPG-CIEF-CZE，蛋白質的分 離結果得到了明顯的改善。由圖4可以看出，7個標準蛋白獲得了較好的分 離。
實施例2
與實施例1不同處在於所採用的樣品為牛奶中提取的蛋白，實驗操作與 實施例1相同。
如圖5所示，採用一維M-IPG-CIEF分離牛奶蛋白的效果很差，蛋白沒 有分開。如圖6所示，釆用2D-M-IPG-CIEF-CZE，牛奶中蛋白質的分離結 果得到了明顯的改善。由圖7可以看出，牛奶蛋白獲得了較好的分離。
權利要求
1. 一種二維毛細管電泳裝置，可用於蛋白質樣品的分離，包括一個2D-CE接口；其特徵在於一根固定化pH梯度毛細管整體柱作為2D-CE的第一維分離柱，其出口端通過連接管與2D-CE接口的一端相連，其進樣端置於裝有鹼性緩衝液的入口貯槽中或與一個注射泵相連；一根毛細管作為2D-CE的第二維分離柱，其進樣端通過連接管與2D-CE接口的另一端相連，其出口端置於裝有酸性緩衝液的貯槽中；2D-CE接口置於裝有酸性緩衝液貯槽中。
2. 按照權利要求1所述二維毛細管電泳裝置，其特徵在於所述的 2D-CE接口為聚四氟乙烯接口 、膜接口和毛細管刻蝕接口 。
3. 按照權利要求1所述二維毛細管電泳裝置，其特徵在於所述的固 定化pH梯度整體柱的內徑可以為100 |Lim 250 |Lim，長度為10 40cm。
4. 按照權利要求l所述二維毛細管電泳裝置，其特徵在於所述第二 維分離柱毛細管的內徑為50或者75pm，長度為10 50cm。
5. 按照權利要求l所述二維毛細管電泳裝置，其特徵在於所述第二 維分離柱毛細管為內壁塗層毛細管或者非塗層毛細管。
6. —種權利要求l所述二維毛細管電泳裝置的應用，其特徵在於 在聚焦前，首先將蛋白質樣品溶液灌滿第一維分離柱(D);1) 在聚焦時，第一維分離柱(D)的進樣端置於裝有鹼性緩衝液的入 口貯槽(A)中，2D-CE接口 (B)貯槽中裝有酸性緩衝液，第二維分離柱(G)出口端與一裝有酸性緩衝液的出口貯槽(C)相連接； 一臺工作高壓 直流電源(I)的地線插入2D-CE接口 (B)處的貯槽中，負極插入第一維 分離柱(D)進樣端入口貯槽(A)中；在入口貯槽(A)處加負高壓，2D-CE 接口 (B)處接地，蛋白質樣品在第--維分離柱(D)中聚焦；2) 在分離時，將第一維分離柱(D)從入口貯槽(A)中取出，第一 維分離柱(D)的進樣端與一個注射泵(J)相連，其他連接方式不變；在 不加電的情況下用注射泵(J)將第一維聚焦的組分區帶分段送入第二維分離柱(G)中；3) 待樣品組分進入第二維時，停止注射泵(J)， 一臺工作高壓直流電 源(I)的兩根地線分別插入2D-CE接口 (B)處的酸性緩衝液貯槽中和注 射泵(J)處，負極插入第二維分離柱(G)出口端緩衝液的出口貯槽(C) 中；出口貯槽(C)加負高壓，注射泵(J)禾Q 2D-CE接口 (B)處接地， 進行蛋白質樣品的2D-CE分離。
7. 按照權利要求6所述二維毛細管電泳裝置的應用，其特徵在於 所述第二維分離柱的分離模式可以為毛細管區帶電泳、毛細管膠束電動色 譜、毛細管凝膠電泳或者毛細管電色譜。
8 二按照權利要求6所述二維毛細管電泳裝置的應用，其特徵在於所述恆流泵的流速可以為0.25 1.0 |jl/min。
9. 按照權利要求6所述二維毛細管電泳裝置的應用，其特徵在於 所述直流電源於第一維或第二維分離柱施加的電壓為5 20kV。
10. 按照權利要求6所述二維毛細管電泳裝置的應用，其特徵在於 所述鹼性緩衝為PH〉10的氫氧化鈉水溶液或者氨水；酸性緩衝為PH<3.5 甲酸、磷酸或者穀氨酸水溶液。
全文摘要
本發明涉及二維毛細管電泳裝置，具體地說是一種新型二維毛細管電泳分離裝置及其應用，可用於蛋白質樣品的分離，包括一個2D-CE接口；一根固定化pH梯度毛細管整體柱作為2D-CE的第一維分離柱，其出口端通過連接管與2D-CE接口的一端相連，其進樣端置於裝有鹼性緩衝液的入口貯槽中或與一個注射泵相連；一根毛細管作為2D-CE的第二維分離柱，其進樣端通過連接管與2D-CE接口的另一端相連，其出口端置於裝有緩衝液的貯槽中；2D-CE接口置於裝有酸性緩衝液貯槽中。採用本發明可以顯著提高系統的峰容量，從而滿足複雜生物樣品的分析需要。
文檔編號C07K1/00GK101469015SQ20071015929
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月28日 優先權日2007年12月28日
發明者孫良亮, 張麗華, 張玉奎, 朱貴傑, 振 梁, 王婷婷, 鄧啟良 申請人:中國科學院大連化學物理研究所