絞股藍核糖體失活蛋白分離方法、產品及其編碼基因的製作方法

2023-07-19 21:16:21

專利名稱：絞股藍核糖體失活蛋白分離方法、產品及其編碼基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種絞股藍(Gynostemma pentaphyllum)活性蛋白以及蛋白的編碼基因，屬生物技術領域，特別相關的領域是生物農藥和生物醫藥領域背景技術根據文獻報導，核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIP)具有抗腫瘤和抗病毒等醫用價值，以及抗植物病毒和病原真菌等農用價值，它是一種多活性的物質，已成為國內外研究的熱點；但不同RIP具有各自獨特的功能，其中的典型代表是國外從美洲商陸(Phytollaca american)中分離的商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviralprotein，PAP)和國內從栝樓(Trichosanthes kirilowii)中分離的天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)。絞股藍具有抗癌和抗衰老等特殊功效，其中的皂甙和黃酮成分的研究已有大量報導，但有關絞股藍活性蛋白(下稱絞股藍RIP)分離方法、產品及其RIP的編碼基因未見報導。

發明內容
本發明提供一種從絞股藍中分離的具有藥用價值的RIP的方法，RIP及其編碼基因，為全面開發絞股藍的藥用價值做出貢獻。
1、絞股藍RIP的分離方法建立了一套以藍色染料假配基Cibacron Blue 3GA親和層析為主，結合硫酸銨分級沉澱和陽離子交換層析的快速分離純化體系。
工藝流程為試劑配製浸提緩衝液含0.14M NaCl的5mM PBS，pH7.4親和緩衝液20mM Tris-HCl，pH7.5離子交換緩衝液10mM PBS，pH6.5取樣、冼淨、涼幹、破碎，加浸提緩衝液，在4℃下放置1d→過濾、離心得浸提液→緩慢加入NH4SO4固體使溶液的NH4SO4最終飽和度達60％，在4℃下過夜，10000rpm離心10min得上清→再加入NH4SO4固體使溶液的NH4SO4最終飽和度達70％，4℃下過夜，10000rpm離心10min得沉澱→溶於蒸餾水中，對蒸餾水透析至無SO2-4，再對親和緩衝液充分平衡透析，離心10min得上清→過親和層析柱(Blue Sepharose 6 Fast Flow)→大量親和緩衝液充分洗脫至A280＜0.02→0.4M NaCl親和緩衝液洗脫→測定A280，收集有明顯A280吸收值的洗脫液→在離子交換緩衝液中充分透析，高速離心，得上清→過陽離子交換柱(離子交換CM Sepharose Fast Flow)→用離子交換緩衝液洗脫至A280＜0.02→0～0.3M NaCl梯度洗脫，1ml/min，3ml/管→測定A280，收集高抗TMV活性的洗脫峰→透析濃縮，得純化RIP。
2、絞股藍RIP的特性及功能特性分子量約為27 kDa，其N-端19個胺基酸序列DINFSLAGADGQTYNTFIA，與其它植物RIP的同源性為10％～73％，與葫蘆科RIP的同源性為37％～73％。
編碼RIP的胺基酸序列為MRVARFCTVVAILLYFGFHIAECDINFSLAGAGGQTYKTFIAKLRQELSIGTQKVANIAVLKHHVYVVGFLTGTNSYIFKEAPDLAYNKSLLFPGSVRENLSYTGGYDDLERRGAGREDIPLGLLPLDTAITNLFRRDSTSFRRSFIVIIQMVSEAARFKIIEAKIAKNLYGENTFKPDQAIISLENNWGALSKQIQKAQDRGGVFPNLVTLTTSSGKPLIIRNDSDPLVQNGIALLKYMSERSVEYSITDDTVNESNGAFLEIMEIHDLM功能與作用採用半葉法接種試驗，測得其抗菸草花葉病毒(TMV)效果為99％；採用MTT法試驗，測得其對胃癌細胞MGC803有抑制增殖和細胞毒作用，說明絞股藍RIP有抗菸草花葉病毒(TMV)，對胃癌細胞MGC803有抑制作用。
絞股藍RIP編碼基因通過其DNA片段克隆、RACE擴增、cDNA克隆和DNA克隆，從絞股藍中分離了RIP基因，與葫蘆科RIP的同源性鹼基水平為47％～61％，胺基酸水平為37％～49％。
其基因序列如下ATGAGAGTTGCTAGATTCTGCACTGTTGTTGCTATTCTTCTCTATTTTGGTTTCCATATCGCCGAATGTGACATTAACTTTAGCCTGGCGGGTGCTGGTGGACAGACTTACAAGACCTTCATTGCAAAACTTCGTCAAGAACTCTCCATTGGCACTCAAAAAGTTGCCAATATAGCTGTGTTGAAGCATCACGTTTACGTTGTGGGATTCCTTACCGGTACCAATTCCTATATATTTAAAGAGGCTCCGGATTTAGCATACAACAAGTCTCTACTTTTCCCTGGTTCCGTACGTGAGAATCTTTCATATACGGGAGGTTATGATGATCTCGAAAGACGAGGAGCTGGAAGAGAAGATATTCCTCTTGGACTCTTACCTTTAGACACAGCTATTACTAACTTGTTTCGTAGAGATTCGACGTCTTTTCGCCGCTCATTTATCGTGATCATTCAAATGGTTTCGGAAGCTGCGAGATTCAAAATTATTGAAGCGAAAATTGCTAAAAATCTTTATGGAGAAAACACGTTTAAGCCAGACCAAGCTATCATAAGTTTGGAAAACAACTGGGGTGCTCTCTCTAAGCAAATTCAGAAAGCACAGGATCGTGGAGGAGTGTTTCCGAATCTGGTTACGCTTACAACTTCTTCGGGTAAGCCGCTTATAATAAGAAATGATTCTGATCCATTAGTTCAGAATGGAATCGCATTGTTGAAATACATGAGTGAAAGAAGTGTTGAATATAGTATTACTGATGACACTGTGAACGAAAGCAATGGGGCTTTTCTGGAGATCATGGAGATTCATGATTTGATGTGA上述絞股藍RIP的分離方法簡單，絞股藍RIP抗TMV和胃癌細胞MGC803效果顯著，其基因的克隆可為大規模表達和應用奠定基礎。
實施例1試劑配製浸提緩衝液含0.14M NaCl的5mM PBS，pH7.4親和緩衝液20mM Tris-HCl，pH7.5離子交換緩衝液10mM PBS，pH6.5取樣1000g絞股藍鮮葉、冼淨、涼幹、破碎，加浸提緩衝液，在4℃下放置1d→過濾、離心得浸提液→緩慢加入NH4SO4固體使溶液的NH4SO4最終飽和度達60％，在4℃下過夜，10000rpm離心10min得上清→再加入NH4SO4固體使溶液的NH4SO4最終飽和度達70％，4℃下過夜，10000rpm離心10min得沉澱→溶於蒸餾水中，對蒸餾水透析至無SO42-，再對親和緩衝液充分平衡透析，離心10min得上清→過親和層析柱(Blue Sepharose 6 FastFlow)→大量親和緩衝液充分洗脫至A280＜0.02→含0.4M NaCl的親和緩衝液洗脫→測定A280，收集有明顯A280吸收值的洗脫液→在離子交換緩衝液中充分透析，高速離心，得上清→過陽離子交換柱(離子交換CM Sepharose Fast Flow)→用離子交換緩衝液洗脫至A280＜0.02→0～0.3M NaCl梯度洗脫，1ml/min，3ml/管→測定A280，收集高抗TMV活性的洗脫峰→透析濃縮，得純化絞股藍RIP。
權利要求
1.一種絞股藍RIP的分離方法，其特徵是建立了一套以藍色染料假配基Cibacron Blue 3GA親和層析為主，結合硫酸銨分級沉澱和陽離子交換層析的快速分離純化方法。
2.根據權利要求1所述的一種絞股藍RIP的分離方法，其特徵是工藝流程為試劑配製浸提緩衝液含0.14M NaCl的5mM PBS，pH7.4親和緩衝液20mM Tris-HCl，pH7.5離子交換緩衝液10mM PBS，pH6.5取樣、冼淨、涼幹、破碎，加浸提緩衝液，在4℃下放置1d→過濾、離心得浸提液→緩慢加入NH4SO4固體使溶液的NH4SO4最終飽和度達60％，在4℃下過夜，10000rpm離心10min得上清→再加入NH4SO4固體使溶液的NH4SO4最終飽和度達70％，4℃下過夜，10000rpm離心10min得沉澱→溶於蒸餾水中，對蒸餾水透析至無SO2-4，再對親和緩衝液充分平衡透析，離心10min得上清→過親和層析柱(Blue Sepharose 6 Fast Flow)→大量親和緩衝液充分洗脫至A280＜0.02→0.4M NaCl親和緩衝液洗脫→測定A280，收集有明顯A280吸收值的洗脫液→在離子交換緩衝液中充分透析，高速離心，得上清→過陽離子交換柱(離子交換CM Sepharose Fast Flow)→用離子交換緩衝液洗脫至A280＜0.02→0～0.3MNaCl梯度洗脫，1ml/min，3ml/管→測定A280，收集高抗TMV活性的洗脫峰→透析濃縮，得純化RIP。
3.一種絞股藍RIP，其特徵是分子量約為27 kDa，其N-端19個胺基酸序列DINFSLAGADGQTYNTFIA，與其它植物RIP的同源性為10％～73％，與葫蘆科RIP的同源性為37％～73％，編碼RIP的胺基酸序列如下MRVARFCTVVAILLYFGFHIAECDINFSLAGAGGQTYKTFIAKLRQELSIGTQKVANIAVLKHHVYVVGFLTGTNSYIFKEAPDLAYNKSLLFPGSVRENLSYTGGYDDLERRGAGREDIPLGLLPLDTAITNLFRRDSTSFRRSFIVIIQMVSEAARFKIIEAKIAKNLYGENTFKPDQAIISLENNWGALSKQIQKAQDRGGVFPNLVTLTTSSGKPLIIRNDSDPLVQNGIALLKYMSERSVEYSITDDTVNESNGAFLEIMEIHDLM。
4.一種絞股藍RIP的編碼基因，通過其DNA片段克隆、RACE擴增、cDNA克隆和DNA克隆，從絞股藍中分離得RIP基因，其特徵是與葫蘆科RIP的同源性鹼基水平為47％～61％，胺基酸水平為37％～49％，基因序列為ATGAGAGTTGCTAGATTCTGCACTGTTGTTGCTATTCTTCTCTATTTTGGTTTCCATATCGCCGAATGTGACATTAACTTTAGCCTGGCGGGTGCTGGTGGACAGACTTACAAGACCTTCATTGCAAAACTTCGTCAAGAACTCTCCATTGGCACTCAAAAAGTTGCCAATATAGCTGTGTTGAAGCATCACGTTTACGTTGTGGGATTCCTTACCGGTACCAATTCCTATATATTTAAAGAGGCTCCGGATTTAGCATACAACAAGTCTCTACTTTTCCCTGGTTCCGTACGTGAGAATCTTTCATATACGGGAGGTTATGATGATCTCGAAAGACGAGGAGCTGGAAGAGAAGATATTCCTCTTGGACTCTTACCTTTAGACACAGCTATTACTAACTTGTTTCGTAGAGATTCGACGTCTTTTCGCCGCTCATTTATCGTGATCATTCAAATGGTTTCGGAAGCTGCGAGATTCAAAATTATTGAAGCGAAAATTGCTAAAAATCTTTATGGAGAAAACACGTTTAAGCCAGACCAAGCTATCATAAGTTTGGAAAACAACTGGGGTGCTCTCTCTAAGCAAATTCAGAAAGCACAGGATCGTGGAGGAGTGTTTCCGAATCTGGTTACGCTTACAACTTCTTCGGGTAAGCCGCTTATAATAAGAAATGATTCTGATCCATTAGTTCAGAATGGAATCGCATTGTTGAAATACATGAGTGAAAGAAGTGTTGAATATAGTATTACTGATGACACTGTGAACGAAAGCAATGGGGCTTTTCTGGAGATCATGGAGATTCATGATTTGATGTGA。
全文摘要
本發明涉及一種絞股藍核糖體失活蛋白(RIP)的分離方法、產品及其RIP編碼基因，屬生物技術領域；建立了以藍色染料假配基Cibacron Blue 3GA親和層析為主，結合硫酸銨分級沉澱和陽離子交換層析的快速分離純化體系；RIP的分子量約為27kDa，其N－端19個胺基酸序列DINFSLAGADGQTYNTFIA，與其它植物RIP的同源性為10％～73％，與葫蘆科RIP的同源性為37％～73％；RIP的抗菸草花葉病毒效果為99％，對胃癌細胞有抑制作用；RIP的編碼基因與葫蘆科RIP的同源性鹼基水平為47％～61％，胺基酸水平為37％～49％；有較為廣泛的醫用和農用價值。
文檔編號C07K14/415GK1482138SQ0314402
公開日2004年3月17日 申請日期2003年7月26日 優先權日2003年7月26日
發明者林奇英, 林毅, 吳祖建, 謝聯輝 申請人:福建農林大學, 福州騰龍生物有限公司