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一種(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物製備方法

2023-07-19 23:39:56 1

一種(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物製備方法
【專利摘要】本發明實施例提供了一種(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物製備方法,屬於生物製藥領域。其製備方法為:在鹽酸三乙醇胺緩衝溶液中,以(5R)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯為原料,在重組酮還原酶及葡萄糖脫氫酶的複合酶、脫滷酶、輔因子和葡萄糖作用下,用氰化試劑維持pH值在6~8,室溫下反應得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯。本發明提供的製備方法以(5R)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯為原料,在重組酮還原酶及葡萄糖脫氫酶的複合酶、脫滷酶的催化下,「一鍋法」完成還原反應和氰基取代反應得到產物,過程簡單且生產成本低。
【專利說明】—種(3R, 5R)-6-氰基-3, 5-二羥基己酸叔丁酯的生物製備
方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物製藥領域,具體涉及阿伐他汀中間體(3R,5R)-6-氰基-3,5_二羥基己酸叔丁酯的生物製備方法。
【背景技術】
[0002]他汀類藥物通過抑制膽固醇合成途徑的HMG-CoA還原酶,降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平,對以膽固醇升高為主的高脂血症有較好的療效,是目前臨床上應用廣泛的血脂調節藥物。阿伐他汀(Atorvastatin)由於其具有起效快、降脂作用強、作用時間長等優點,成為全新第三代、全合成、高純化、高選擇性的HMG-CoA還原酶抑制劑,是目前最有市場前景的他汀類藥物。而(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯是阿伐他汀的最為重要的中間體,因而,開展對(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的合成改進,對阿伐他汀製備方法的研究具有十分重要的作用。
[0003](3R, 5R)-6-氰基_3,5_ 二羥基己酸叔丁酯是合成阿伐他汀側鏈的重要的中間體,其化學結構為:
【權利要求】
1.一種(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物製備方法,其特徵在於,在鹽酸三乙醇胺緩衝溶液中,以(5R)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯為原料,在重組酮還原酶及葡萄糖脫氫酶的複合酶、脫滷酶、輔因子和葡萄糖作用下,用氰化試劑維持PH值在6~8,室溫下反應得到(31?,51?)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯;在起始時的反應體系中,所述複合酶、脫滷酶、輔因子、葡萄糖和(5R)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯的質量比為0.01 ~0.02: 0.01 ~0.02:0.0005 ~0.002:1 ~2:1。
2.根據權利要求1所述的生物製備方法,其特徵在於,所述重組酮還原酶及葡萄糖脫氫酶的複合酶的製備方法為:將攜帶酮還原酶基因和葡萄糖脫氫酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含氨苄青黴素和卡拉黴素雙抗性的液體LB培養基中,於35~40°C下搖床活化8~12小時,將活化後得到的培養物接種到含氨苄青黴素和卡拉黴素雙抗性的液體LB培養基中,於35~40°C下搖床擴大培養,至OD6tltl值達到0.8~I時,加入誘導劑,於35~40°C下繼續培養4~8小時,離心,收集沉澱物,加入鹽酸三乙醇胺緩衝液得懸浮液,將懸浮液置於冰水浴中超聲破壁10~20分鐘,再離心,將上清液預凍至溫度降至-15~-25°C,然後再冷凍乾燥24~48小時,即得所述重組酮還原酶和葡萄糖脫氫酶的複合酶。
3.根據權利要求1所述的生物製備方法,其特徵在於,所述脫滷酶的製備方法為:將攜帶脫滷酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含氨苄青黴素的液體LB培養基中,於35~40°C下搖床活化8~12小時,將活化後得到的培養物接種到含氨苄青黴素的液體LB培養基中,於35~40°C下搖床擴大培養,至OD6tltl值達到0.8~I時,加入誘導劑,於35~40°C下繼續培養4~8小時,離心,收集沉澱物,加入鹽酸三乙醇胺緩衝液得懸浮液,將懸浮液置於冰水浴中超聲破壁10~20分鐘,再離心,將上清液預凍至溫度降至-15~-25°C,然後再冷凍乾燥24~48小時,即得所述狀脫滷酶。
4.根據權利要求2或者3所述的生物製備方法,其特徵在於,所述誘導劑為異丙基-β -D-硫代半乳糖苷。
5.根據權利要求1或2或3所述的生物製備方法,其特徵在於,所述鹽酸三乙醇胺緩衝液的濃度為0.05Μ~0.15Μ。
6.根據權利要求1所述的生物製備方法,其特徵在於,所述(5R)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯與鹽酸三乙醇胺緩衝溶液的質量體積比為150-300mg/mL。
7.根據權利要求1所述的生物製備方法,其特徵在於,所述輔因子為NAD/NADH或NADP/NADPHo
8.根據權利要求1所述的生物製備方法,其特徵在於,所述氰化試劑為氰化鈉溶液或氰化鉀溶液,其質量濃度為10~30%。
9.根據權利要求1所述的生物製備方法,其特徵在於,其製備方法具體為:在鹽酸三乙醇胺緩衝溶液中依次加入重組酮還原酶及葡萄糖脫氫酶的複合酶、脫齒酶、輔因子、葡萄糖和(5R) -6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯,攪拌均勻,用氰化鈉溶液或氰化鉀溶液維持pH值在6~8,室溫攪拌反應,反應完成後加入乙酸乙酯進行多次萃取,合併有機相併減壓蒸去溶劑,即得所述(3R,5R) -6-氰基-3,5- 二羥基己酸叔丁酯。
【文檔編號】C12P13/00GK103695486SQ201410001100
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月3日 優先權日:2014年1月3日
【發明者】張龑, 熊進軍, 葛石平 申請人:黃岡華陽藥業有限公司, 黃岡師範學院

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