人尿液中兒茶酚胺類物質和其甲氧基代謝物含量的檢測方法與流程
2023-07-17 16:29:56 1
本發明屬於臨床藥物分析檢測技術領域，具體是一種人尿液中兒茶酚胺類物質和其甲氧基代謝物含量的檢測方法。
背景技術：
嗜鉻細胞瘤(Pheochromocytomas)是腎上腺髓質及腎上腺外副神經節系統產生兒茶酚胺的嗜鉻細胞所發生的腫瘤。主要的臨床症狀表現為陣發性的高血壓、頭痛、心悸、焦慮、出汗和高血糖。兒茶酚胺類物質主要有去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)、腎上腺素(Epinephrine，E)和多巴胺(Catecholamine，CA)，嗜鉻瘤細胞分泌大量的兒茶酚胺類物質使得交感神經功異常增強和持續，導致上述症狀的發生。去甲苄腎上腺素(Normetanephrine，NMN)和間甲腎上腺素(Metanephrine，MN)是兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)的代謝產物。有報導稱：甲氧基代謝產物(MNs)中的MN和NMN是比較好的診斷嗜鉻細胞瘤的生物檢測手段。與兒茶酚胺類物質相比，MNs具有更長的半衰期、更穩定的血藥濃度和不容易受到食物和藥物的影響。COMT廣泛分布於腎上腺髓質和嗜鉻細胞瘤細胞，MNs的濃度與腫瘤的體積密切相關。據文獻報導，測定游離的甲氧基代謝產物更為普遍和適用。測定多巴胺類化合物(CAs)和MNs含量的方法主要有毛細管電泳法、LC-ECD、LC-MS等。目前，臨床檢測血液或尿樣中兒茶酚胺類物質和其甲氧基代謝物採用的是離子對液相色譜-電化學檢測方法，該方法在流動相的水相中加入了磺酸鹽作為離子對，造成色譜柱平衡時間長、噪聲較大基線不穩定、有時峰形拖尾較為嚴重。
本發明旨在通過改性的C18色譜柱，簡化流動相組成，縮短平衡色譜柱時間，獲得良好的色譜分離曲線，從而建立臨床上尿液中兒茶酚胺類物質和其甲氧基代謝物含量的高效液相色譜電化學檢測法。
技術實現要素：
解決的技術問題：本發明的目的是解決現有尿樣中兒茶酚胺類物質和其甲氧基代謝物的檢測方法色譜柱平衡時間長、噪聲較大基線不穩定、峰形拖尾較為嚴重的技術問題，提供一種固相萃取-高效液相色譜電化學檢測法，該方法可以縮短色譜柱平衡時間，噪聲小、基線較平穩、峰性較為尖銳，有效地延長色譜柱的使用壽命。
技術方案：人尿液中兒茶酚胺類物質和其甲氧基代謝物含量的檢測方法，是將尿液樣品經酸化預處理後進行固相萃取，然後採用高效液相色譜電化學法檢測。
所述酸化預處理是指用10mol/L的鹽酸溶液將尿液樣品酸化至pH1.0。
所述固相萃取是指將預處理的尿液樣品上樣至萃取柱，用水淋洗後再用2％氨化甲醇洗脫。
所述高效液相色譜電化學法的色譜柱為ACCHROM XCharge C18柱、流動相為0.2v/v％三氟乙酸水溶液、柱溫為30℃、流速為1.0mL/min、檢測電壓為+0.9V。
有益效果：固相萃取-高效液相色譜電化學檢測法測定人尿液中兒茶酚胺類物質和其甲氧基代謝物的含量，主要通過選用改性的C18色譜柱，克服了傳統的離子對高效液相色譜-電化學法對其檢測的缺點，如流動相含有辛烷磺酸鈉等易造成水相中產生氣泡、色譜柱平衡時間長、噪聲較大基線不穩定、有時峰形拖尾較為嚴重等，採用小分子揮發性三氟乙酸水溶液作為流動相，縮短色譜柱平衡時間、噪聲小、基線較平穩、峰性較為尖銳，大大改善了色譜條件，獲得良好的色譜分離曲線，可滿足臨床上尿液中兒茶酚胺類物質和其甲氧基代謝物的含量檢測要求。
本發明選用三氟乙酸水溶液為流動相，與採用含EDTA、辛烷磺酸鈉、磷酸鹽緩衝液及乙腈流動相的方法相比，本發明可以縮短色譜柱平衡時間，噪聲小、基線較平穩、峰性較為尖銳，有效的延長色譜柱的使用壽命。
附圖說明
圖1中(A)為流動相三氟乙酸濃度與組分保留時間關係圖，(B)為0.2v/v％三氟乙酸與組分和空白樣品幹擾雜質保留時間關係圖，a為1.0μg/mL標準對照品，b為空白尿樣；
圖2為檢測電壓與響應峰面積的關係圖；
圖3為四種物質的標準曲線，(1)為去甲腎上腺素、(2)為腎上腺素、(3)為去甲苄腎上腺素、(4)為間甲腎上腺素；
圖4為尿液樣品測定的HPLC-ECD色譜流出圖，1為去甲腎上腺素、2為腎上腺素、3為去甲苄腎上腺素、4為間甲腎上腺素、5為內標物異丙腎上腺素，a為樣品、b為空白對照、c為標準品。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
本發明提供了一種人尿液中兒茶酚胺類物質和其甲氧基代謝物含量的檢測方法，包括以下步驟：
步驟1，尿液樣品預處理：將尿液樣品用10mol/L的鹽酸溶液酸化至pH1.0，並儲存在-20℃冰箱中；
步驟2，供試品溶液的製備：先將Cleanert PCX-SPE萃取小柱用甲醇和水活化後，將預處理好的尿液樣品上樣至萃取柱，用水淋洗後用2％的氨化甲醇洗脫，收集的溶液經氮氣吹乾後用流動相溶解，然後用尼龍NYLL濾頭過濾；
步驟3，混合標準溶液的配製：取1.0mg/mL的甲腎上腺素、腎上腺素、去甲苄腎上腺素、間甲腎上腺素對照品儲備液分別配製成濃度為0.050μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL和50.0μg/mL的混合標準溶液，含內標異丙腎上腺素2.0μg/mL，按尿液樣品預處理和供試品溶液製備步驟製備一系列混合標準溶液；
步驟4，精密量取供試品溶液和混合標準溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；
色譜柱：ACCHROM XCharge C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；
流動相：0.2v/v％三氟乙酸(TFA)水溶液；
柱溫：30℃；
流速：1.0mL/min；
進樣量：20.0μL；
檢測電壓：+0.9V(vs.Hy-REF reference electrodes)。
步驟5，採用異丙腎上腺素未內標物，以被測物質的峰面積與內標物峰面積比對被測物質濃度進行線性擬合，得工作曲線，根據供試品溶液得到的峰面積和擬合得到的工作曲線，計算人尿液中甲腎上腺素、腎上腺素、去甲苄腎上腺素、間甲腎上腺素的含量。
檢測方法的建立
(1)條件的優化
①流動相的優化
分別取4種對照品溶液和內標稀釋成濃度為1.0μg/mL的對照品混合溶液，改變流動相水相中三氟乙酸的濃度分別為0.05v/v％、0.1v/v％、0.15v/v％、0.2v/v％，其他按色譜條件分別進樣，結果見圖1(A)。三氟乙酸在流動相的濃度越大化合物的保留時間越長，有利於各組分色譜峰的分離；但是由於色譜柱pH的適用範圍在1-9，因此三氟乙酸的濃度必須保證在色譜柱耐受的pH範圍之內。此外，0.2v/v％三氟乙酸水溶液能將空白樣品中的幹擾物質與待測組分分離，且分析時間適宜，最終選擇0.2v/v％三氟乙酸水溶液作為流動相，結果見圖1(B)。
②檢測電壓的選擇
分別取4種對照品溶液稀釋成濃度為1.0μg/mL的對照品混合溶液，將電化學檢測器的檢測電壓分別設置成0.7V、0.8V、0.9V、1.0V、1.1V、1.2V和1.3V，其他按色譜條件分別進樣。由圖2可知：電壓在0.7-0.9V之間響應隨電壓增大而增大，在0.9V之後響應逐漸減弱，因此實驗選擇0.9V電壓作為檢測電壓。
③固相微萃取柱的選擇
CAs和MNs都具有鹼性氨基結構，鹼性樣品通常按照陽離子交換的原理進行樣品的前處理。有報導採用不同機制填料的固相萃取柱對嗜鉻細胞瘤陽性尿液進行淨化處理，如弱陽離子交換柱(WCX)，混合型陽離子交換柱(MCX)，hydrophilic–lipophilic balance(HLB)。本實驗採用PCX(Agela，混合型陽離子交換固相萃取小柱)、SCX(陽離子交換小柱)、MCX(Waters,混合型陽離子交換小柱)、WCX(Waters,弱陽離子交換小柱)處理空白樣品和添加標準對照品的空白尿液，考察不同類型的SPE小柱的幹擾去除能力以及待測物的回收率。結果表明：SCX、MCX和WCX固相萃取柱可能由於過強的吸附性或太弱的保留能力，洗脫液中待測物組分含量很少，回收率不高(均小於50％)。PCX則具有較強的去除雜質的效果和較高的回收率，有更好的提取和純化能力，因此選擇PCX-SPE進行樣品預處理。並對對PCX-SPE的洗脫條件進行優化，其最優條件為：先後2mL甲醇和1mL水活化柱子後，在酸性條件下上樣1mL，用10mL的水淋洗柱子，最後用3mL 2％的氨化甲醇洗脫。最後測定了10μg·mL-1混合標準溶液過固相萃取柱後回收率(表1)。
表1 PCX固相萃取的回收率
(2)方法學建立
①線性範圍
取一系列經固相為萃取柱進行預處理的混合濃度標準溶液(0.050μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL和50.0μg/mL；含2.0μg/mL內標物異丙腎上腺素)進樣，每個濃度進樣三次，考察響應被測物與內標物峰面積比與其濃度的線性關係等(表2)。四種性物質的線性相關係數r均在0.995以上。標準曲線見圖3。
②檢測限與定量限
將去甲腎上腺素、腎上腺素、去甲苄腎上腺素、間甲腎上腺素的對照品儲備液稀釋配製成10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL混合溶液，按照尿樣樣品的預處理步驟處理後進樣，以信噪比3和10分別測定檢測限和定量限，結果見表2。
表2 HPLC-ECD測得的四中化合物的線性回歸方程、相關係數和線性範圍
③精密度與重複性
以甲腎上腺素、腎上腺素、去甲苄腎上腺素、間甲腎上腺素的對照品儲備液配製成終濃度為0.10μg/mL、1.0μg/mL、10.0μg/mL的混合溶液，含內標2.0μg/mL,按照尿樣樣品的預處理步驟處理後進樣，每種濃度一天內連續進樣六次，其響應峰面積的RSD％為日內精密度；每種濃度連續測定三天，每天測定六次，其響應峰面積的RSD％為日間精密度(見表3)。四種被測物的日內和日間精密度均小於或等於2.0％，說明該方法具有良好的精密度與重現性。
表3 四種化合物不同濃度水平的日內和日間精密度(n＝6)
*4種化合物的濃度水平為0.10μg/mL、1.0μg/mL、10.0μg/mL
(3)樣品含量及回收率的測定
按照在優化後的色譜條件，將尿樣預處理方法後製得供試品溶液僅進行色譜實驗，得到色譜流出曲線。重複進樣3次，結果取平均值，得到尿樣樣品中去甲腎上腺素、腎上腺素、去甲苄腎上腺素和間甲腎上腺素的含量。含量計算：外標曲線法計算尿樣樣品中甲腎上腺素、腎上腺素、去甲苄腎上腺素、間甲腎上腺素的含量。
取一嗜鉻細胞瘤陽性尿樣，按照先前建立高效液相色譜電化學檢測法測定樣品中各組份的含量，然後在該嗜鉻細胞瘤陽性尿樣中分別準確加入三種不同濃度水平1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的混合標準品溶液，按尿樣樣品的預處理步驟製得供試品後進行回收率測定。結果表明：4個組分甲腎上腺素、腎上腺素、去甲苄腎上腺素、間甲腎上腺素的回收率基本都在80％-120％之間，表明該實驗方法準確可靠，滿足臨床實際樣品中四種化合物的分離與檢測。回收率＝(檢測值－樣品溶液中各組份的濃度)/各組份對照品加標濃度×100％。
本發明選用0.2％三氟乙酸水溶液為流動相，與採用含EDTA、辛烷磺酸鈉、磷酸鹽緩衝液及乙腈流動相的方法相比，本發明可以縮短色譜柱平衡時間，噪聲小、基線較平穩、峰性較為尖銳，有效的延長色譜柱的使用壽命。