具有1,3-丁二醇生產功能的基因重組微生物及其應用的製作方法

2023-07-20 11:17:56

專利名稱：具有1,3-丁二醇生產功能的基因重組微生物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及賦予了 1，3-丁ニ醇生產功能的基因重組微生物，和使用所述微生物生產1，3-丁ニ醇的方法。背景領域I, 3- 丁ニ醇可用作具有多種用途的化學品，例如保溼劑、樹脂原料、表面活性剤、吸溼劑和溶劑等，以及作為它們的原材料而具有利用價值。它的光學活性分子(R)_l，3-丁ニ醇和(S)-1，3-丁ニ醇也可用作醫藥、農藥等的合成原料而具有利用價值。常規上，I, 3- 丁ニ醇是通過以化石資源石油為基礎通過化學方法製造的こ醛作為原料，形成丁間醇醛後，進行氫化的化學方法製造的。另ー方面，可以通過專利文件I展示 的方法生產光學活性的1，3- 丁ニ醇，在專利文件I展示的方法中通過使能夠優先同化其-或(R)-異構體的微生物(例如，近平滑假絲酵母(Candidapalapsilosis)或乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)等)作用於從化石資源化學合成的外消旋1，3_丁ニ醇，然後收集剩餘的對映體，來生產(R)-或(S)-I, 3-丁ニ醇。此外，在專利文件2展示的方法中，通過使微生物(例如，乳酸克魯維酵母或近平滑假絲酵母等)作用於從化石資源化學合成的4-羥基-2- 丁酮，利用微生物的不對稱還原活性，生產(R) _或(S)-1，3-丁ニ醇。此外，還有在一個或兩個步驟中使用立體選擇性的氧化還原酶或大量表達此類酶的基因重組菌生產光學活性的1，3-丁ニ醇的方法。此類方法包括使用地黴屬(Geotricumsp.)來源的(S)-特異性的仲醇脫氫酶，由外消旋體生產(R)-l，3-丁ニ醇(非專利文件I);使用表達近平滑假絲酵母來源的(S)-特異性的仲醇脫氫酶的基因重組大腸桿菌(Escherichia coli),由外消旋體生產(R)_l，3_ 丁ニ醇(專利文件3);使用表達乳酸克魯維酵母來源的(R)-特異性的2，3-丁ニ醇脫氫酶的基因重組大腸桿菌，由4-羥基-2-丁酮生產(R)-1，3-丁ニ醇，或由外消旋體生產(S)-1，3-丁ニ醇(專利文件4)。然而，所有這些方法都使用需要非天然化合物作為底物，必須化學合成底物。同時，在非專利文件2中，在含有木薯廢棄物的培養基中培養Geotricumfragrans的培養液中檢測到1，3- 丁ニ醇。然而，I, 3- 丁ニ醇是作為ー種揮發性的物質而被發現，其目的不在於生產1，3-丁ニ醇。在近年，出於化石資源耗盡和全球變暖的觀點，對於建立使用生物量(biomass)(植物資源)來源的原料作為可再生資源的化學品生產體系具有日益增長的社會需求。例如，已知可以從ー種生物量(biomass)來源的材料——葡萄糖，利用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)所示的丙酮-丁醇發酵通路,通過CoA衍生物生產溶劑。對於該物種的典型菌株，丙酮丁醇梭菌ATCC824，已測序了其完整的基因組DNA序列，並已經掲示了丙酮-丁醇發酵細菌的特徵性溶劑生產基因adhE (具有ECl. 2. I. 10和ECl. I. I. I兩功能的醛-醇脫氫酶)(非專利文件3)。只有極少數關於丙酮丁醇梭菌來源的adhE的基因產物(具有ECl. 2. I. 10和ECl. I. I. I兩功能的醛-醇脫氫酶)的酶學報告，並且在非專利文件4中，僅對使用丙酮丁醇梭菌DSM1732的無細胞提取液，以丁醇或丁醛作為底物，實施了對丁醇脫氫酶活性的評估，和使用丁醛或丁醯-CoA作為底物，實施了對丁醛脫氫酶活性的評估。adhE基因產物從未被用於除非專利文件5所示的生產I- 丁醇以外的其他目的。沒有關於從生物量來源的原料生產1，3-丁ニ醇的報導，需要從可再生的資源(如生物量等)生產1，3- 丁ニ醇的方法。現有技術文件專利文件專利文件I :日本專利申請公開出版號(JP-A)H02_195897(未審查，已出版的日 本專利申請)專利文件2 JP-A (公開)H02-31684專利文件3 JP-A (公開)2000-197485專利文件4 JP-A (公開)2002-345479非專利文件非專利文件I :Biosci. Biotech. Biochem.，1996，60(7)，1191-1192非專利文件2 Proc. Biochem.，2003，39，411-414非專利文件3 J. Bacteriol.，2001，183 (16)，4823-4838非專利文件4 Appl. Microbiol. Biotechnol.，1987，26，268-272非專利文件5 Metabol. Engineer.，2008，10，305-311發明概述發明要解決的問題本發明的目標是提供能夠以生物量(植物資源)的可再生資源作為原料生產1，3-丁ニ醇的微生物。本發明的另ー個目標是提供可以使用具有目的功能的微生物生產1，3-丁ニ醇的方法。解決問題的方法作為深入研究開發從可再生的資源即生物量作為原料生產1，3- 丁ニ醇的方法的結果，本發明人發現丙酮丁醇梭菌來源的AdhE (CaAdhE)不僅通過NADH依賴性的方式還原こ醯-Cok和丁醯-CoA產生こ醛和丁醛，而且令人驚訝的通過還原在3位具有羥基的3-羥丁醯-CoA，產生3-羥基丁醛。本發明人還發現，CaAdhE具有以NADH依賴性的方式還原3-羥基丁醛的活性，從而催化產生1，3- 丁ニ醇的反應。通過以葡萄糖作為碳源，培養能夠共表達CaAdhE、β -酮硫解酶(β -ketothiolase)(催化從2分子的こ醯-CoA生成こ醯こ醯-Cok的反應)和3-羥丁醯-Cok脫氫酶(催化以NAD(P)H-依賴性的方式，還原こ醯こ醯-CoA的3-羰基生成3-羥丁醯-CoA的反應)的基因重組大腸桿菌，成功的實現了有效生產1，3-丁ニ醇。基於上述發現，本發明人利用微生物所具有的代謝產物即こ醯-CoA，通過使在含上述酶的微生物中發生下述式8表示的反應，成功的生產了 1，3- 丁ニ醇，從而完成了本發明。即本發明提供生產1，3- 丁ニ醇的微生物。本發明還提供使用此類微生物有效生產1，3_ 丁ニ醇的方法。[式8]
權利要求
1.下述(I)的酶活性得到增強的基因重組微生物，所述基因重組微生物由發酵底物生產式2代表的1，3_烷基ニ醇， (I)按照式I所示，使用NADH和/或NADPH作為輔酶，通過還原3-羥基醯基-Coh,來催化生產3-羥基烷基醛的酶活性
2.權利要求I的基因重組微生物,其中在權利要求I中所述的式I和2中的R均是甲基，由發酵底物生產1，3- 丁ニ醇。
3.權利要求I或2的基因重組微生物，其中權利要求2所述的由發酵底物生產的1，3-丁ニ醇是(R)-1,3-丁ニ醇。
4.權利要求I至3中任ー項的基因重組微生物，其中催化權利要求I的(I)所述的式I代表的反應的酶在國際酶學分類中分類為EC I. 2. I. 10。
5.權利要求I至4中任ー項的基因重組微生物，其中催化權利要求I的(I)所述的式I代表的反應的酶是下述(a廣下述(e)中任ー項所述的酶 (a)具有SEQID NO: 1、65或67的胺基酸序列的蛋白質； (b)具有在SEQID NO: 1、65或67的胺基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一個或多個胺基酸的胺基酸序列的酶； (c)具有由SEQID NO:2、66或68的核苷酸序列編碼的胺基酸序列的酶； (d)具有由在嚴格的條件下與包括SEQID NO: 2、66或68的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼的胺基酸序列的酶；和 (e)與SEQID NO: 1、65或67的胺基酸序列具有85%或更高的同一性的蛋白質。
6.權利要求I至5中任ー項的基因重組微生物，其是除權利要求I所述的下述(I)的酶活性之外，下述(2)的酶活性也得到增強的基因重組微生物，所述基因重組微生物由發酵底物生產式2代表的1，3-烷基ニ醇， (1)按照式I所示，使用NADH和/或NADPH作為輔酶，通過還原3-羥基醯基-Coh,來催化生產3-羥基烷基醛的酶活性；和 (2)按照式3所示，使用NADH和/或NADPH作為輔酶，通過還原3-羥基烷基醛，來催化生產式2代表的1，3-烷基ニ醇的酶活性， 式3沒有顯示兩個反應，而僅顯示了由醛生產醇 [式I]
7.權利要求6的基因重組微生物，其中在權利要求6中所述的式I至3中的R均是甲基，由發酵底物生產1，3- 丁ニ醇。
8.權利要求6或7的基因重組微生物，其中權利要求7所述的由發酵底物生產的1，3-丁ニ醇是(R)-1,3-丁ニ醇。
9.權利要求6至8中任ー項的基因重組微生物，其中催化權利要求6中所述的式3代表的反應的酶是下述(a廣下述(e)中任ー項所述的酶 (a)具有SEQID N0:3、5或7的胺基酸序列的蛋白質； (b)具有在SEQID N0:3、5或7的胺基酸序列中取代、缺失、插入或添加了ー個或多個胺基酸的胺基酸序列的酶； (c)具有由SEQID N0:4、6或8的核苷酸序列編碼的胺基酸序列的酶； (d)具有由在嚴格的條件下與包括SEQID N0:4、6或8的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼的胺基酸序列的酶；和 (e)與SEQID N0:3、5或7的胺基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
10.權利要求I至5中任ー項的基因重組微生物，其是除權利要求I所述的下述(I)的酶活性之外，下述(3)的酶活性也得到增強的基因重組微生物，所述基因重組微生物由發酵底物生產式2代表的1，3-烷基ニ醇 (I)按照式I所示，使用NADH和/或NADPH作為輔酶，通過還原3-羥基醯基-Coh,來催化生產3-羥基烷基醛的酶活性；和 (3)按照式4所示，以NADH和/或NADPH依賴性的方式還原3-氧代醯基-Coh,生產3-羥基醯基-CoA的酶活性， [式I]
11.權利要求10的基因重組微生物，其中在權利要求10中所述的式I和2中的R均是甲基，由發酵底物生產式5代表的(R)-1，3-丁ニ醇， [式5]
12.權利要求10或11的基因重組微生物，其中催化權利要求10中所述的式4代表的反應的酶是R型特異性還原酶，且是下述(a廣下述(e)中任一項所述的酶 (a)具有SEQID N0:9、ll、13、15或17的胺基酸序列的蛋白質； (b)具有在SEQID N0:9、ll、13、15或17的胺基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一個或多個胺基酸的胺基酸序列的酶；(c)具有由SEQID NO: 10、12、14、16或18的核苷酸序列編碼的胺基酸序列的酶； (d)具有由在嚴格的條件下與包括SEQID NO: 10、12、14、16或18的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼的胺基酸序列的酶；和(e)與SEQID N0:9、ll、13、15或17的胺基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
13.生產式2代表的ニ醇化合物的方法，其包括 將發酵底物與至少ー種活性物質接觸的步驟，所述活性物質選自權利要求I至12中任ー項的基因重組微生物的培養物、菌體、及其處理物；和收集式2代表的1，3-烷基ニ醇的步驟， [式2]
14.權利要求13的生產ニ醇化合物的方法，其中生產的ニ醇化合物是式5代表的(R)-1，3-丁ニ醇， [式5]
15.權利要求13或14的生產ニ醇化合物的方法，其中分別進行培養基因重組微生物的步驟和生產ニ醇化合物的步驟。
全文摘要
本發明的目的是提供有效生產光學活性的1,3-丁二醇的基因重組微生物，所述1,3-丁二醇作為醫藥的合成原料等有利用價值，以及提供使用基因重組微生物有效生產光學活性的1,3-丁二醇的方法。本發明人等為了解決上述問題，進行了深入的研究，結果成功的生產了這樣的基因重組微生物，其催化由式1代表的還原性反應的酶活性得到增強，並生產由式2代表的二醇化合物。(式中R代表C1-3烷基或氫)(式中R代表C1-3烷基或氫)
文檔編號C12N15/09GK102686719SQ20108006027
公開日2012年9月19日 申請日期2010年10月29日 優先權日2009年10月30日
發明者中島賢則, 岡林智仁, 山本浩明 申請人:株式會社大賽璐