一種鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法

2023-07-20 08:10:11

專利名稱：一種鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法
技術領域：
本發明屬於組織培養快速繁殖技術領域，具體涉及一種鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法。
背景技術：
MU^M (.DencIrobium chrysanthum Wall, ex Lindl.)為蘭科石斛屬植物，別名金弓石斛，主要分布於我國的雲南、廣西、貴州等省，以及馬來西亞、印度、緬甸等國家。據 《中國藥典》記載其味淡、性微寒，有滋陰養胃，清熱解毒的功效；在臨床上多用於治療慢性咽喉炎、眼科疾病、血栓閉塞性疾病，效果十分明顯；化學成分及藥理活性研究表明鼓槌石斛中含有鼓槌菲、毛蘭素等抗腫瘤活性成分，是脈絡寧、通塞脈片、石斛液光丸等著名中成藥的主要原料之一。當前，由於過量挖採，野生資源已經瀕臨滅絕，成為稀缺藥材。同時，鼓槌石斛也是一種優良的觀賞植物，金黃色的小花格外奪目，10-20朵花構成總狀花序， 豔麗多姿。目前，國內外對鼓槌石斛快速繁殖技術的研究，主要集中在種子萌發形成愈傷組織、原球莖，然後進行分化、壯苗和生根培養，獲得完整植株。通過這種技術培育獲得的鼓槌石斛後代性狀分離程度高，個體之間差異大，難以實現性狀一致的植株，阻礙了鼓槌石斛原生物種的保護及鼓槌石斛在花卉市場上的開發利用。因此，研究鼓槌石斛克隆技術，培育性狀一致的植株，對保護鼓槌石斛和滿足花卉市場的需求，實現人工規模化生產顯得十分關鍵。

發明內容
有鑑於此，本發明所解決的技術問題在於提供了一種鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法，通過叢生芽的途徑進行鼓槌石斛組織培養能夠獲得大量遺傳性狀穩定的試管苗，保持良好的親本特性，並且具備包括不變性、投入少、產出高、周期短在內的諸多優勢。本發明通過以下技術方案來解決上述技術問題
一種鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法，包括以下步驟
1)外植體的消毒選取5-8釐米長的幼嫩芽，去除包片，用自來水衝洗乾淨後剪成兩段，在超淨工作檯上依次通過酒精和升汞溶液進行處理，而後用無菌水衝洗5 8次後，用無菌濾紙吸乾殘餘水分，切取1-2釐米長帶有側芽尖的莖段接種在誘導培養基上；
2)叢生芽的誘導採用誘導培養基培養10 15天，芽尖增大；30 40天，新芽形成並生長；培養過程中，光照強度1500 20001x，光照10 12小時/天，溫度25 28°C ；
3)叢生芽的增殖利用芽尖培養得到的叢生芽，剪取部分葉片後轉移到叢生芽增殖培養基，培養40 60天，獲得大量的叢生芽；培養條件為光照強度1500 20001x，光照 10 12小時/天，溫度25 28°C ；
4)繼代培養採用繼代培養基進行繼代培養，每40 60天繼代增殖1次，並將繼代次數控制在15次內；培養條件為光照強度1500 20001x，光照10 12小時/天，溫度 25 28 ；5)生根培養當繼代苗達到合適數量後，採用生根培養基進行生根培養，得到生根苗； 培養條件為光照強度1500 20001x，光照10 12小時/天，溫度25 28°C。培養30 50天；
6)試管苗移栽選擇每年3 5月份為出瓶移栽的季節，或者提供類似3 5月份自然條件的生長環境進行出瓶移栽；移栽前，試管苗放置於具自然光散射的溫室中煉苗10 15 天，然後從試管中取出小苗，清洗根部的培養基，並放於高錳酸鉀溶液中浸泡3 5分鐘，取出後用水苔種植於口徑的塑料杯盆中；溫室須保持通風，溼度在70 80%，溫度保持在15°C 以上至室溫範圍內，高於30°C必須用風機、水簾降溫。優選地，所述誘導培養基成分為1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤0. 5 1. 0啤/1+腺嘌呤 1. 0 1. 5 mg /L+AgN03 5. 0 10. 0 mg /L +10. 0 20. 0% 椰子汁 +5. 0 10. Og/L 活性炭， 培養基PH值為5. 5-5.8。優選地，所述叢生芽增殖培養基為1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤1. 0 3. 0啤/1+腺嘌呤 0. 5 1. 0 mg /L+AgN03 5. 0 10. 0 mg /L +10. 0 20. 0% 椰子汁 +5. 0 10. Og/L 活性炭。優選地，所述繼代培養基為1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤1. 0 3. 0啤/1+腺嘌呤 0. 5 1. 0 mg /L+AgN03 5. 0 10. 0 mg /L +10. 0 20. 0% 椰子汁 +5. 0 10. Og/L 活性炭。優選地，所述生根培養基為MS+萘乙酸0. 2 0. 5 mg /L+10. 0 20. 0%椰子汁 +5.0 10. Og/L活性炭。優選地，所述外植體的消毒步驟中，依次通過酒精和升汞溶液進行處理是指用70% 的酒精浸泡15 45秒，再用0. 1%的升汞溶液滅菌8 12分鐘。優選地，所述試管苗移栽中，用於浸泡小苗根部的高錳酸鉀溶液為0. 1%的高錳酸鉀溶液。相比於現有技術，本發明的鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法的有益效果在於該方法操作容易，生產成本低，不汙染環境，能夠實現規模化生產。通過本發明培育出的鼓槌石斛種苗，其遺傳性狀穩定，保持了親本的特性，具備包括不變性、投入少、產出高、周期短在內的諸多優勢。
具體實施例方式有鑑於此，本發明具體實施方式
中提供的一種鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法，具體包括以下步驟
1)外植體的消毒選取5-8釐米長的幼嫩芽，去除包片，用自來水衝洗乾淨後剪成兩段，在超淨工作檯上依次通過酒精和升汞溶液進行處理，而後用無菌水衝洗5 8次後，用無菌濾紙吸乾殘餘水分，切取1-2釐米長帶有側芽尖的莖段接種在誘導培養基上；
2)叢生芽的誘導採用誘導培養基培養10 15天，芽尖增大；30 40天，新芽形成並生長；培養過程中，光照強度1500 20001x，光照10 12小時/天，溫度25 28°C ；
3)叢生芽的增殖利用芽尖培養得到的叢生芽，剪取部分葉片後轉移到叢生芽增殖培養基，培養40 60天，獲得大量的叢生芽；培養條件為光照強度1500 20001x，光照 10 12小時/天，溫度25 28°C ；
4)繼代培養採用繼代培養基進行繼代培養，每40 60天繼代增殖1次，並將繼代次數控制在15次內；培養條件為光照強度1500 20001x，光照10 12小時/天，溫度 25 28 ；
5)生根培養當繼代苗達到合適數量後，採用生根培養基進行生根培養，得到生根苗； 培養條件為光照強度1500 20001x，光照10 12小時/天，溫度25 28°C。培養30 50天；
6)試管苗移栽選擇每年3 5月份為出瓶移栽的季節，或者提供類似3 5月份自然條件的生長環境進行出瓶移栽；移栽前，試管苗放置於具自然光散射的溫室中煉苗10 15 天，然後從試管中取出小苗，清洗根部的培養基，並放於高錳酸鉀溶液中浸泡3 5分鐘，取出後用水苔種植於口徑的塑料杯盆中；溫室須保持通風，溼度在70 80%，溫度保持在15°C 以上至室溫範圍內，高於30°C必須用風機、水簾降溫。上述各個步驟中涉及到的處理方式、培養條件、培養時間和培養基的成分都會根據具體需要進行適當的調整。其中，各培養在成分確定的情況下，其中用到的各組分的含量可根據實際的培養情況進行調整，上述方法中用到的培養基成分和各成分的含量範圍如下
叢生芽的誘導步驟中，誘導培養基成分為1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤0. 5 1. Omg/L+腺嘌呤 1. 0 1. 5 mg /L+AgN03 5. 0 10. 0 mg /L +10. 0 20. 0% 椰子汁 +5. 0 10. Og/L 活性炭，培養基PH值為5. 5-5.8。叢生芽的增殖步驟中，叢生芽增殖培養基為1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤1. 0 3. 0 mg /L+ 腺嘌呤 0. 5 1. 0 mg /L+AgN03 5. 0 10. 0 mg /L +10. 0 20. 0% 椰子汁 +5. 0 10. Og/L活性炭。繼代培養步驟中，繼代培養基為1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤1. 0 3. 0 mg /L+腺嘌呤 0. 5 1. 0 mg /L+AgN03 5. 0 10. 0 mg /L +10. 0 20. 0% 椰子汁 +5. 0 10. Og/L 活性炭。生根培養步驟中，生根培養基為MS+萘乙酸0. 2 0. 5 mg /L+10. 0 20. 0%椰子汁+5.0 10. Og/L活性炭。另外，由於培養過程受諸如溫度、光照、溼度等多種因素的影響，因而，在本發明的各步驟中，處理方式、培養條件、培養時間都會根據具體需要進行適當的調整。其中，外植體的消毒步驟中，依次通過酒精和升汞溶液進行處理是指用70%的酒精浸泡15 45秒，再用0. 1%的升汞溶液滅菌8 12分鐘。另外，所述試管苗移栽中，用於浸泡小苗根部的高錳酸鉀溶液為0. 1%的高錳酸鉀溶液。為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。實施例1
選取5-8釐米長的幼嫩芽，去除包片，用自來水衝洗乾淨後剪成兩段，在超淨工作檯上用70%的酒精浸泡15秒，再用0. 1%的升汞溶液滅菌8分鐘，無菌水衝洗5次後，用無菌濾紙吸乾殘餘水分，切取1-2釐米長帶有側芽尖的莖段接種在誘導培養基為l/2MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0. 5mg/L+AD (腺嘌呤)1. 0 mg /L+AgN03 5.0 mg/L +10. 0% 椰子汁+5. Og/L 活性炭上，光照強度1500 20001x，光照10小時/天，溫度25 28°C。培養40 55天， 新芽形成並生長。利用芽尖培養得到的叢生芽，剪取部分葉片後轉移到叢生芽增殖培養基 1/2MS+6-BA (6-節氨基腺嘌呤)1. Omg /L+AD (腺嘌呤)0. 5 mg /L+AgN03 5 . 0 mg /L +10. 0% 椰子汁+5. 0g/L活性炭，在光照強度1500 20001x，光照10小時/天，溫度25 28°C條件下，培養40 60天，獲得大量的叢生芽，增殖倍數可達3. 0。每40 60天繼代增殖1次，一般繼代次數不超過15次，繼代培養基為1/2MS+6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)1. 0 mg /L+AD (腺嘌呤)0. 5mg/L+AgN03 5. Omg/L +10. 0%椰子汁+5. Og/L 活性炭，在光照強度 1500 20001x， 光照10小時/天，溫度25 28°C條件下培養。當繼代苗達到一定數量後，可以進行生根培養，生根培養基為MS+NAA (萘乙酸)0. 2 mg /L+00. 0%椰子汁+5. Og/L活性炭，在光照強度 1500 20001x，光照10小時/天，溫度25 28°C的條件下培養，培養30 50天，得到生根苗。春季為出瓶移栽的季節，移栽前，試管苗放置於具自然光散射的溫室中煉苗15天，然後從試管中取出小苗，清洗根部的培養基，並放於0. 1%的高錳酸鉀溶液中浸泡5分鐘，取出後用水苔種植於口徑4. 8cm的塑料杯盆中，並保持溫室通風，溼度在70 80%，溫度保持在 15°C以上，高於30°C必須用風機、水簾降溫，移栽成活率可達90%。實施例2
選取5-8釐米長的幼嫩芽，去除包片，用自來水衝洗乾淨後剪成兩段，在超淨工作檯上用70%的酒精浸泡30秒，再用0. 1%的升汞溶液滅菌10分鐘，無菌水衝洗6次後，用無菌濾紙吸乾殘餘水分，切取1-2釐米長帶有側芽尖的莖段接種在誘導培養基為 ΙΛΜΞ+Θ-ΒΑ^-苄氨基腺嘌呤)0.75mg/L+AD (腺嘌呤)1. 25 mg/L+AgN03 7.5 mg /L +15. 0%椰子汁+7. 5g/L活性炭上，光照強度1500 20001x，光照11小時/天，溫度25 28°C。培養40 55天，新芽形成並生長。利用芽尖培養得到的叢生芽，剪取部分葉片後轉移到叢生芽增殖培養基1/2MS+6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)1. 5 mg /L+AD (腺嘌呤)0. 75 mg / L+AgN03 7. 5 mg /L +15. 0%椰子汁+7. 5g/L活性炭，在光照強度1500 20001x，光照11小時/天，溫度25 28°C條件下，培養40 60天，獲得大量的叢生芽，增殖倍數可達4. 0。每 40 60天繼代增殖1次，一般繼代次數不超過15次，繼代培養基為1/2MS+6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)1. 5 mg /L+AD (腺嘌呤)0. 75 mg /L+AgN03 7. 5 mg /L +15. 0% 椰子汁 +7. 5g/L 活性炭，在光照強度1500 20001x，光照11小時/天，溫度25 28°C條件下培養。當繼代苗達到一定數量後，可以進行生根培養，生根培養基為MS+NAA(萘乙酸)0. 35 mg /L+15. 0%椰子汁+7. 5g/L活性炭，在光照強度1500 20001x，光照11小時/天，溫度25 28°C的條件下培養，培養30 50天，得到生根苗。春季為出瓶移栽的季節，移栽前，試管苗放置於具自然光散射的溫室中煉苗15天，然後從試管中取出小苗，清洗根部的培養基，並放於0. 1% 的高錳酸鉀溶液中浸泡5分鐘，取出後用水苔種植於口徑4. 8cm的塑料杯盆中，並保持溫室通風，溼度在70 80%，溫度保持在15°C以上，高於30°C必須用風機、水簾降溫，移栽成活率可達90%。實施例3
選取5-8釐米長的幼嫩芽，去除包片，用自來水衝洗乾淨後剪成兩段，在超淨工作檯上用70%的酒精浸泡45秒，再用0. 1%的升汞溶液滅菌12分鐘，無菌水衝洗8次後，用無菌濾紙吸乾殘餘水分，切取1-2釐米長帶有側芽尖的莖段接種在誘導培養基為 l/2MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)1. 0 mg/L+AD(腺嘌呤)1. 5 mg /L+AgN03 10.0 mg /L +20. 0%椰子汁+10. Og/L活性炭上，光照強度1500 20001x，光照12小時/天，溫度25 28°C。培養40 55天，新芽形成並生長。利用芽尖培養得到的叢生芽，剪取部分葉片後轉移到叢生芽增殖培養基1/2MS+6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)3. 0 mg /L+AD (腺嘌呤)1. 0啤/ L+AgN03 10. 0 mg /L +20. 0% 椰子汁 +10. Og/L 活性炭，在光照強度 1500 20001x,光照 12小時/天，溫度25 28°C條件下，培養40 60天，獲得大量的叢生芽，增殖倍數可達6. 0。 每40 60天繼代增殖1次，一般繼代次數不超過15次，繼代培養基為1/2MS+6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)3. 0 mg /L+AD (腺嘌呤)1. 0 mg /L+AgN03 10. 0 mg /L +20. 0% 椰子汁 +10. Og/L 活性炭，在光照強度1500 20001x，光照12小時/天，溫度25 28°C條件下培養。當繼代苗達到一定數量後，可以進行生根培養，生根培養基為MS+NAA(萘乙酸)0. 5 mg /L+20. 0%椰子汁+10. Og/L活性炭，在光照強度1500 20001x，光照12小時/天，溫度25 28°C的條件下培養，培養30 50天，得到生根苗。春季為出瓶移栽的季節，移栽前，試管苗放置於具自然光散射的溫室中煉苗15天，然後從試管中取出小苗，清洗根部的培養基，並放於0. 1% 的高錳酸鉀溶液中浸泡5分鐘，取出後用水苔種植於口徑4. 8cm的塑料杯盆中，並保持溫室通風，溼度在70 80%，溫度保持在15°C以上，高於30°C必須用風機、水簾降溫，移栽成活率可達90%。 相比於現有技術，上述方式中揭示的鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法，操作容易，生產成本低，不汙染環境，能夠實現規模化生產。通過本發明培育出的鼓槌石斛種苗， 其遺傳性狀穩定，保持了親本的特性，具備包括不變性、投入少、產出高、周期短在內的諸多優勢。最後所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。
權利要求
1.一種鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法，其特徵在於該方法包括以下步驟1)外植體的消毒選取5-8釐米長的幼嫩芽，去除包片，用自來水衝洗乾淨後剪成兩段，在超淨工作檯上依次通過酒精和升汞溶液進行處理，而後用無菌水衝洗5 8次後，用無菌濾紙吸乾殘餘水分，切取1-2釐米長帶有側芽尖的莖段接種在誘導培養基上；2)叢生芽的誘導採用誘導培養基培養10 15天，芽尖增大；30 40天，新芽形成並生長；培養過程中，光照強度1500 20001x，光照10 12小時/天，溫度25 28°C ；3)叢生芽的增殖利用芽尖培養得到的叢生芽，剪取部分葉片後轉移到叢生芽增殖培養基，培養40 60天，獲得大量的叢生芽；培養條件為光照強度1500 20001x，光照 10 12小時/天，溫度25 28°C ；4)繼代培養採用繼代培養基進行繼代培養，每40 60天繼代增殖1次，並將繼代次數控制在15次內；培養條件為光照強度1500 20001x，光照10 12小時/天，溫度 25 28 ；5)生根培養當繼代苗達到合適數量後，採用生根培養基進行生根培養，得到生根苗； 培養條件為光照強度1500 20001x，光照10 12小時/天，溫度25 28°C，培養30 50天；6)試管苗移栽選擇每年3 5月份為出瓶移栽的季節，或者提供類似3 5月份自然條件的生長環境進行出瓶移栽；移栽前，試管苗放置於具自然光散射的溫室中煉苗10 15 天，然後從試管中取出小苗，清洗根部的培養基，並放於高錳酸鉀溶液中浸泡3 5分鐘，取出後用水苔種植於口徑的塑料杯盆中；溫室須保持通風，溼度在70 80%，溫度保持在15°C 以上至室溫範圍內，高於30°C必須用風機、水簾降溫。
2.如權利要求1所述的鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法，其特徵在於所述誘導培養基成分為1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤0. 5 1. 0啤/1+腺嘌呤1. 0 1. 5啤/L+AgN03 5. 0 10. Omg/L +10. 0 20. 0% 椰子汁+5. 0 10. Og/L 活性炭，培養基 PH 值為 5. 5-5. 8。
3.如權利要求1所述的鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法，其特徵在於所述叢生芽增殖培養基為1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤1. 0 3. 0啤/1+腺嘌呤0. 5 1. 0啤/L+AgN03 5. 0 10. 0 mg /L +10. 0 20. 0% 椰子汁 +5. 0 10. Og/L 活性炭。
4.如權利要求1所述的鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法，其特徵在於所述繼代培養基為1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤1. 0 3. 0 mg /L+腺嘌呤0. 5 1. 0 mg /L+AgN03 5. 0 10. 0 mg /L +10. 0 20. 0% 椰子汁 +5. 0 10. Og/L 活性炭。
5.如權利要求1所述的鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法，其特徵在於所述生根培養基為MS+萘乙酸0. 2 0. 5 mg /L+10. 0 20. 0%椰子汁+5. 0 10. Og/L活性炭。
6.如權利要求1所述的鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法，其特徵在於所述外植體的消毒步驟中，依次通過酒精和升汞溶液進行處理是指用70%的酒精浸泡15 45秒，再用0. 1%的升汞溶液滅菌8 12分鐘。
7.如權利要求1所述的鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖方法，其特徵在於所述試管苗移栽中，用於浸泡小苗根部的高錳酸鉀溶液為0.1%的高錳酸鉀溶液。
全文摘要
本發明提供了一種鼓槌石斛芽尖組織培養快速繁殖的方法，依次經過芽的誘導培養、叢生芽的增殖培養、叢生芽的繼代培養、以及生根培養後，得到完整植株，即可出瓶煉苗，並移栽。本發明的方法操作容易，生產成本低，不汙染環境，可以實現規模化生產。通過本發明培育出的鼓槌石斛種苗，其遺傳性狀穩定，保持了親本的特性，具備包括不變性、投入少、產出高、周期短在內的諸多優勢。
文檔編號A01H4/00GK102217551SQ20111015897
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月14日 優先權日2011年6月14日
發明者呂復兵, 孫映波, 操君喜, 朱根發, 陳和明 申請人:廣東省農業科學院花卉研究所