C-反應性蛋白質片斷的部分改性的和逆轉化的四肽類似物的製作方法

2023-08-09 19:21:01 2

專利名稱：C-反應性蛋白質片斷的部分改性的和逆轉化的四肽類似物的製作方法
技術領域：
本發明涉及C-反應性蛋白質片斷(以下稱CRP)的逆轉化的四肽類似物。
CRP是一種通常具有很低血液濃度的蛋白質。炎症出現後它的血液濃度可上升到2000倍〔J.J.Morley and I.Kushner，Am.N.Y.Acad.Sci.，389，406-418(1989)〕。F.A.Robey等在J.Biol.Chem.，262，No.15，7053-7057(1987)中披露了三種非常類似於tuftsin序列的CRP四肽序列。化學合成的四肽以一種定性和定量上類似tuftsin的方式顯示以下特性刺激吞噬細胞的白血球，產生超氧化物和誘導單核細胞產生interleukin 1。象tuftsin一樣，這三種CRP四肽應在體內迅速地被蛋白酶新陳代謝，並產生能有力地抑制母體肽的生物活性的肽代謝物。我們驚奇地發現，上述CRP四肽片斷的部分改性和N-末端逆轉化的類似物不僅顯示了在保持tuftsin的免疫調節活性的同時具有相當大的抗酶降解的穩定性(見EP-A-0253 190)，而且特別的是它們能決定不同的取決於結構和使用劑量的生物效應(特別是在敗血症的休克治療中)。所以本發明涉及結構式Ⅰ的逆轉化的四肽
其中R是一個氫原子或蘇氨酸的側鏈;R1是精氨酸、亮氨酸或穀氨醯胺的側鏈;R2是一個氫原子或一種代謝上不經久的醯基;當R1是精氨酸的側鏈時，R不可能是蘇氨酸的側鏈。本發明還涉及四肽的非對映立體異構體的形式和藥理上可接受的鹽類、酯類和醯胺類。
本發明特別地涉及逆轉化的四肽gGly-(R，S)mLys-Pro-Arg，gThr-(R，S)mLys-Pro-Leu，gThr-(R，S)mLys-Pro-Gln，其中前綴g和m表示胺基酸分別是一種偕二胺和丙二醯殘基。
本發明的逆轉化的四肽按與已知方法一致的方法合成。本技術領域的熟練人員可根據需要逆轉化的胺基酸種類選擇這些方法。
例如，當偕二胺殘基是1，1-二氨基甲烷基團(gGly)時，逆轉化的四肽可按如下製備首先在一種矽烷化試劑，例如，N，O-雙(三甲基甲矽烷基)乙醯胺(TSMAc)，三甲基甲矽烷基氯(TMS-Cl)或三甲基甲矽烷基氰化物(TMSCN)存在下使Meldrum氏酸的衍生物C-mLys(Z)(即5-〔4-苯甲氧基羰基〕-2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮)和H-Gly-NH2反應(M.J.O.Anteunis Chr.Becu，Bull.Soc.Chim.Belg。，96，119-139，1986)。如此得到的準肽OH-(R，S)mLys(Z)-Gly-NH2(Z為苯甲氧基羰基)的丙二醯殘基上的第二個基團在二環己基碳化二亞胺(DCC)和1-羥基苯並三唑(HOBT)存在下與脯氨酸叔丁酯縮合，得到準肽〔(R，S)mLys(Z)-Gly-NH2〕-Pro-H。這種準肽的脯氨酸羰基團DCC和N-羥基琥珀酸亞胺(HOSu)活化，然後與未保護的精氨酸反應〔Gott lieb，P.等，Ann.N.Y.Acad.，419，12(1983)〕，得到逆轉化的四肽〔(R.S)mLys(Z)-Gly-NH2〕-Pro-Arg-OH。提純可通過RP-DC頂替(deplacement)色譜法進行，如果希望的話，通過這種方法還可能分離非對映立體異構體。純化了的產品在鈀存在下用HCOOH催化氫化，除掉剩餘的保護基團，然後用〔I，I-雙(三氟乙醯氧基)碘代〕苯(TIB)處理使甘氨醯胺變為gGly的N-末端殘基。用離子交換色譜的最後一次純化能得到以乙酸酯形式的最終產物。
另一個例子是蘇氨酸為偕二胺殘基。逆轉化的四肽的合成從一種C-末端二肽開始。這種C-末端二肽是通過Z-Pro-OH與H-Y-OtBu縮合，其中Y代表與結構式Ⅰ所定義的一致的胺基酸Leu和Gln(任選適當地加以保護)，和接著通過催化氫化除去苯甲氧基羰基基團而得到。然後將這種二肽與N-末端逆轉化的二肽反應，該N-末端逆轉化的二肽的製備，例如，義大利專利申請No.21349A/90中有描述。
用二苯基磷疊氮化合物處理在適當的羰基活化試劑存在下，用MNP-COOH醯化預先已被矽烷化的H-Thr(t Bu)-OH所得到的NMP-Thr(t Bu)-OH，從而得到相應的疊氮化合物。這種疊氮化合物通過加熱而得到異氰酸酯。在催化量的胺，優選一種叔胺和三乙胺或二異丙胺存在下用苯硫酚處理這種疊氮化合物，得到苯硫代羰基衍生物MNP-gThr(t Bu)-PTC。然後胺殘基被去保護，例如，通過用稀釋的氫氧化鈉處理，得到MNP-gThr(t Bu)-H。該MNP-gThr(t Bu)-H與c-mLys(Boc)縮合得到N-末端準二肽MNP-gThr(t Bu)-(R，S)mLys(Boc)，它接著在DCC/HOBT存在下與H-Pro-Y-OtBu(其中Y如上所定義)縮合，得到被保護的結構式Ⅰ的逆轉化的四肽(其中R是1-羥基乙基)。通過用酸處理，所有保護基團(除偕二胺殘基外)都被除去。如果需要的話，有可能在通過RP-DC提純的同時分離兩種非對映立體異構體。MNP基團可通過催化氫化除去，例如，通過使用吸附於海綿狀鈀上的甲酸銨。逆轉化的四肽用合適的色譜方法進行最後的提純。
這裡我們提供了一些代表我們所要求的逆轉化四肽的製備實施例。這些實施例決不是用來限制本發明。
胺基酸衍生物，被保護片斷和逆轉化的四肽的HPLC分析在下列實驗條件下進行
柱Lichrosorb RP-18;
流量1.5ml/min;
檢測器Merck L-4200 UV-VIS(230或254nm);
洗脫液A水90%，乙腈10%，三氟乙酸(TFA)0.1%;
洗脫液B乙腈，TFA0.1%;
洗脫液C水，TFA0.1%;
梯度(Ⅰ)從0至40%B在A中(20′)，到80%B在A中(10′)(Ⅱ)從37至80%B在A中(20′)(Ⅲ)從0至50%A在C中(20′)，到100%A(3′)，到40%B在A中(20′)(Ⅳ)從10至40%A在C中(8′)，到100%A(2′)，到40%B在A中(20′)在離子交換提純中，使用裝備有LKB UVICORD S Ⅱ檢測器(帶有226nm的過濾器)，Pharmacia記錄儀(記錄速度為0.1釐米/分鐘)和Pharmacia FRAC200級分收集器的Pharmacia HPLC系統。
各種逆轉化的肽的胺基酸和NH3組成和比率(作為偕二胺殘基的具體數據)在用6MHCl於110℃水解22小時後用Beckman SYSTEM GOLD自動胺基酸分析儀測定。
一些化合物名稱後的括號中的字母數字碼是一種識別內碼。
實施例1H-gGly-(R，S)mLys-Pro-Arg-OH·2AcOH(ITF1127)A)往一種H-Gly-NH2·HCl(3.32g，30mmoles)於THF中形成的乳濁液中依次加入TMSAc(19.6ml，80mmoles)和TMSACl(2.54ml，20mmoles)。30分鐘後加入c-mLys(Z)(6.98g，20mmoles)，反應混合物於室溫下再攪拌3小時。真空蒸發掉溶劑，殘留物用水(200ml)溶解，並用0.1NHCl把PH值調至3。室溫下攪拌1小時後，形成的固體過濾出來，用水洗，然後溶於熱的乙醇中。冷卻後得到的固體過濾出來，用乙醚洗，乾燥，得到3.8g(R，S)mLys(Z)-Gly-NH2(產率51%)。HPLC〔梯度(Ⅰ)(254nm)〕r.t(保留時間)13.5分鐘;純度98%;熔點161℃(dec.)1H-NMR證實了產物的結構。
B)水浴冷卻下往A)中產物(3.65g，10mmoles)溶於DMF(15ml)形成的溶液中依次加入HOBT(1.43g，10.5mmoles)。攪拌30分鐘後，過濾混合物，將濾液加到HCl·H-Pro-OtBu(2.49g，12mmoles)和TEA(1.67ml，12mmoles)的DMF(10ml)溶液中。混合物攪拌3小時，然後真空蒸發掉溶劑。殘留物用乙酸乙酯(50ml)溶解，有機相用2%硫酸氫鉀，5%碳酸氫鈉洗滌，用水中和，然後用硫酸鈉脫水。將得到的4.2g輕油(產率82%)溶於DMC和TFA的混合物(11V/V，16ml)中，攪拌1小時。真空蒸發溶劑，殘留物用乙酸乙酯和乙醚研磨，得到3.6g〔(R，S)mLys(Z)-gly-NH2〕-Pro-OH白色固體(產率79%)。
HPLC〔梯度(Ⅰ)(254nm)〕r.t.14.6和15.7分鐘(兩個非對映立體異構體);純度97%。
1H-NMR證實了產物的結構。
C)往B)中產物(3.36g，7.5mmoles)溶於THF(50ml)形成的溶液中加入HOSu(0.95g，8.25mmoles)，冷卻到-10℃後，加入DCC(1.54g，7.5mmoles)。於室溫攪拌4小時後，過濾反應混合物，將濾液加到含H-Arg-OH(1.74g，10mmoles)和KCl(0.74g，10mmoles)的DMF/水(73V/V，125ml)溶液中。反應混合物於室溫攪拌保持90分鐘，然後真空蒸發掉溶劑，殘留物用乙醚洗幾次，乾燥。將得到的固體溶於TFA水溶液(0.16V/V，30ml)中，分三等份通過RP-DC提純。每次提純時，把10ml溶液以2.7ml/min的流量注入Dynamax 300
C18(21.4×300mm)柱中，這種柱子預先用含TFA(0.1%V/V)的水穩定。加完料後，用含TFA(0.1% V/V)的氯化十六烷基苄基二甲基銨(BOHA-Cl)水溶液(50mM)仍以2.7ml/min洗脫柱子。洗脫約1小時後，收集到2.7ml級分。級分用HPLC〔梯度(Ⅰ)〕分析。含雜質的級分被除掉，而其它級分各自獨立地按三組收集。這三組級分分別包含化合物〔mLys(Z)-Gly-NH2〕-Pro-Arg-OH的異構體A，兩種異構體的混合物和異構體B。在三次色譜分離完後，凍幹這三組級分得到1.9g異構體A，0.45g異構體混合物和1.8g異構體B(總產率89%)。
HPLC〔梯度(Ⅰ)(220nm)〕r.t.13.6分鐘(異構體A)，純度96%;r.t.14.7分鐘(異構體B);異構體A純度93%+4%。FAB-MSm/z＝619amu(原子質量單位)〔M+H〕+;m/z＝485amu〔M-Z+H〕+(兩種異構體的識別譜)。
D)把新鮮的海綿狀鈀(約0.1g)加到C)中異構體混合物(0.31g，0.5mmoles)的甲酸(85%，5ml)溶液中，混合物於室溫下緩慢攪拌90分鐘。濾除催化劑後，真空蒸除溶劑。殘留物用水溶解並凍幹。將所得固體溶於DMF/水(31V/V，5ml)的混合物中，加入TIB(0.43g，1mmoles)。反應混合物於室溫下避光攪拌16小時。真空蒸除溶劑，將殘留物溶於水，用乙醚洗滌並凍幹。將所得固體溶於pH值為6的水中。然後注入(流量為1ml/min)一個填充有CM-52羰甲基纖維素並預先用pH值為6的乙酸銨溶液(15mM)穩定的柱中(6×200mm)。加完料後，用0.15mM到150mM成線性梯度的乙酸銨洗脫分離柱。洗脫時間為6小時，流量為1ml/min，並維持PH值為6。收集到3ml級分，並用HPLC〔梯度(Ⅲ)〕分析收集含標題產物(ITF 1127)的級分並多次凍幹。將得到的固體溶於無水乙醇，加入乙醚沉澱得到0.085g產物(產率30%。
HPLC〔梯度(Ⅲ)〕r.t.8.8分鐘(異構體A)和10.2分鐘(異構體B);純度99%。
FAB-MSm/z＝457amu〔M+H〕+。
按相似方法得到0.425g(產率30%)異構體A(ITF 1357)。
1H-NMR(200MHz;DMSO)按異構體A的方法得到0.45g異構體B(ITF 1358)(產率32%)和0.1g混合物(ITF 1127)。
HPLC〔梯度(Ⅲ)〕10.2分鐘;純度96%+異構體AFAB-MSm/z＝457amu〔M+H〕1H-NMR(200MHz;DMSO)t(1H;NGH)8.30;d(0.4H;NHR)7.57;d(0.6H;NHR)7.47;m(1H;CαP)4.43;m(3H;αG;αR)3.97÷3.82;m(4H;δP;δK)3.63÷3.33;m(2H;δR)3.06;m(2H;εK)2.72;s(6H CH3COO-)1.76;m(14H;β，τP;β，τ，δK;β，τR)1.21÷1.15.
實施例2H-gTHr-(R，S)mLys-Pro-Leu-OH·AcOH(ITF 1192)A)在0℃往碳酸雙(三氯甲基)酯(3.71g，12.5mmoles)二氯甲烷(125ml)形成的溶液中加入溶於80ml二氯甲烷的1-甲基咪唑(5.96ml，75mmoles)。5分鐘後，加入溶於二氯甲烷(80ml)的MNP-OH(5.63g，25mmoles)，再過5分鐘後，加入預先用TMSCN(11，3ml，90mmoles)矽烷化的H-THr(tBu)-OH(5.26g，30mmoles)並再加入200ml二氯甲烷。10分鐘後，用酸化到pH3.5的水相緩衝液洗滌反應混合物，脫水蒸發至乾燥。用5%碳酸鈉溶液(300ml)溶解的殘留物用二氯甲烷洗滌。再加200ml乙酸乙酯到水相中，並將pH值調到5.7。分離有機相併脫水，蒸除溶劑得到油狀MNP-Thr(tBu)-OH(6.5g，產率68%)。HPLC〔梯度(Ⅰ)(254nm)〕r.t.25.1分鐘;純度88%。
B)在0℃往A)中化合物(5.2g，13.6mmoles)溶於無水甲苯(50ml)形成的溶液中加入DPPA(3.22ml，14.9mmoles)和TEA(2.09ml，14.9mmoles)。4小時後反應混合物用碳酸氫鈉飽和溶液和氯化鈉飽和溶液(各自預先冷卻到0℃)洗三次，然後脫水。將含疊氮化合物的溶液加熱到80℃，並在此溫度下保持40分鐘。在室溫下往形成的異氰酸酯中加入苯硫酚(1.39ml，13.6mmoles)和催化量的TEA(191μl，1.36mmoles)。一夜以後，用乙酸乙酯和水處理混合物，有機相用2%硫酸氫鉀，5%碳酸氫鈉洗滌，並用水中和，然後用硫酸鈉脫水，蒸發至乾燥，得到的油用石油醚研磨。得到4.7gMNP-gTHr(tBu)-PCT(產率71.2%)。HPLC〔梯度(Ⅱ)(254nm)〕r.t.14.9分鐘;純度95%。
C)往處於0℃的氫氧化鈉(1M，26ml)和水(877ml)的混合物中緩慢加入B)中產物(4.7g，9.6mmoles)溶於THF(64ml)形成的溶液。加料結束5分鐘後，用HCl(1M，26ml)中和反應混合物。蒸發除掉THF，加入氯仿(80ml)並用1M氫氧化鈉將兩相混合物pH值調至9.0。分離有機相。用氯仿處理水相三次，每次都把pH值調至9.0。收集有機相，蒸發乾燥。往重新懸浮於乙醚的殘留物中加水(50ml)，用1MHCl把混合物滴至pH3.5，直到pH值恆定。分離水相，並將這種處理過程重複兩次。凍幹收集的水相得到2.8gMNP-gTHr(tBu)-H·HCl(產率85%)。
HPLC〔梯度(Ⅰ)(254nm)〕r.t.16.43分鐘;純度99.9%。
D)往C)中化合物(2.6g，6.6mmoles)和c-mLys(Boc(2.4g，8mmoles)溶於THF(120ml)形成的溶液中緩慢加入TMSAc(4.6ml，20mmoles)。20小時後蒸發反應混合物，用水溶解殘留物並在乙醯乙酯存在下用1MHCl把pH值調至3.5。水相用乙酸乙酯萃取三次。使收集的有機相脫水，使之減少到較小體積，加入二異丙醚，得到3.4gMNP-gThr(tBu)-(R，S)mLys(Boc)-OH(產率85%)。
HPLC〔梯度(Ⅱ)(230nm)〕r.t.9.9分鐘和10.2分鐘(兩種非對映立體異構體);純度93%。
E)往Z-Pro-OH(2.4g，10mmoles)和H-Leu-OtBu·HCl(2.7g，12mmoles)溶於二氯甲烷(50ml)形成的溶液中加入TEA(3ml，22mmoles)，然後加入BOP(4.4g，10mmoles)和HOBT(1.35g，10mmoles)。5小時後反應混合物用飽和氯化鈉溶液處理一次，然後蒸發乾燥。殘留物在乙酸乙酯和水之間分配。有機相用2%硫酸氫鉀，5%碳酸氫鈉洗滌，用水中和並在硫酸鈉中脫水，然後乾燥。通過添加石油醚，從溶於二異丙醚的殘留物得到3.8gZ-Pro-Leu-OtBu(產率92.7%)。
HPLC〔梯度(Ⅰ)(230nm)〕r.t.28.6分鐘;純度100%。
F)讓E)中二肽(1.5g，3.5mmoles)溶於甲醇(70ml)，在氮氣中把Pd/c催化劑(100mg)加到這種溶液中，然後緩緩地加入三乙基矽烷(2.9ml，18mmoles)。3小時後過濾反應混合物，蒸發除掉溶劑，得到1g H-Pro-Leu-OtBu(產率100%)。HPLC〔梯度(Ⅰ)(230nm)〕r.t.15.9分鐘;純度93%。
G)往D)中準二肽(1.1g，1.9mmoles)溶於二氯甲烷(15ml)形成的溶液中加入溶於200mlDMF的HOBT(320mg，2.3mmoles)。將溫度調至0℃並加入DCCI(392mg，1.9mmoles)。15分鐘後，將混合物濾入一個含E)中C-末端二肽(540mg，1.9mmoles)的燒瓶中，並放置使之反應一夜。蒸發除掉溶劑後，殘留物在乙酸乙酸和水之間分配，有機相用2%硫酸氫鉀，5%碳酸氫鈉洗滌，並用水中和，然後在硫酸鈉中脫水。通過用二異丙醚研磨殘留物從乾燥的有機相中得到12.3gMNP-gThr(tBu-(R，S)mLys(Boc)-Pro-Leu-OtBu(產率77%)。
HPLCisocratic 從65%的B(230和254nm)r.t.8.2和8.6分鐘;純度100%。
H)在水溶中用濃HCl(5ml)處理一等分部分G)中化合物(1.4g，1.3mmoles)8分鐘。將反應混合物蒸至乾燥，然後用水溶解，並凍幹，得到910mg粗產品。這種粗產品使用溴化幹二烷基苄基二甲基銨(BDDA-Br，50mM於90%水，10%乙腈和0.1%TFA中)作為置換劑，以2.7ml/min的流量在一種Dynamax柱(300AC18，12μm，21×250mm)上通過RP-DC提純。這樣回收3種級分的NMP-gThr-mLys-Pro-Leu-OH320mg異構體A，320mg異構體B和160mg非對映立體異構體混合物。
HPLC〔梯度(Ⅰ)(230nm)〕r.t.16.1和18分鐘;純度99.9%。
Ⅰ)將H)中異構體A(315mg，0.4mmoles)溶於甲醇(15ml)中，加入用甲酸活化的海綿狀鈀和甲酸銨(120mg)溶於甲酸(5ml)形成的溶液。2小時後濾除催化劑，蒸除溶劑後用水溶解殘留物。水相用乙醚洗滌，凍幹得到200mg粗產品。這種粗產品在一種S-Sepharose Fast Flow的Pharmacia XK16柱(16×20mm)上通過離子交換提純。用0.015M，PH6.0的乙酸銨(A)和0.3M，PH6.0的乙酸銨(B)作為洗脫液，以0-25%B在A中的線性梯度洗脫(30′)，然後於isocratic中40分鐘，以3ml/min的流量洗脫。用HPLC分析每2分鐘收集的級分並將含標題產物的級分凍幹。
HPLC〔梯度(Ⅲ)(230nm)〕r.t.12.8分鐘;純度97%。
胺基酸組成Pro(1)1.0;Leu(1)1.0;NH3(2)1.9;肽含量77μmoles(40mg;產率20%)。
1H-NMR(200MHz;1H-DMSO;30℃)(異構體A-ITF1432)d(1H;NH-gT)7.79;d(1H;NH-L)6.93;m(2H;Cα-P，Cα-gT)4.31÷4.21;q(1H;Cα-L)3.84;m(1H;Cδ-P)3.74;m(3H;Cδ2P;CB-gT;Cα-mK)3.63÷3.37;m(2H;Cε-mK)2.75;m(4H;Cβ，Cτ-P)2.19÷1.74;m(9H;Cβ，Cτ，Cδ-mK;Cβ，Cτ-L)1.73÷1.13;d(3H;Cτ-gT)1.06;d(3H;Cδ1L)0.88;d(3H;Cδ2L)0.87.
按與異構體A相同的方法得到異構體B(ITF1443)1H-NMR(200MHz;1H-DMSO;30℃)d(0.9H;NAH-gT)8.13;d(0.1H;NBH-gT)8.03;d(0.1H;NBH-L)7.45;d(0.9H;NAH-L)7.36;m(2H;Cα-P，Cα-gT)4.37÷4.24;m(1H;Cα-L)3.86;m(3H;Cδ-P;Cβ-gT)3.56÷3.38;m(1H;Cα-mK)3.16;m(2H;Cε-mK)2.76;m(13H;Cβ，Cτ-P;Cβ，Cτ，Cδ-mK;Cβ，Cτ-L)2.23÷1.15;d.(3H;Cτ-gT)1.03;d(6H;Cδ-L)0.88.
例3H-gThr-(R，S)mLys-Pro-Gln-OH·AcOH(ITF1193)A)將Z-Gln-OH(5.6g，20mmoles)溶於冰乙酸(60ml)中，加入Trt-OH(Trt＝三苯甲遊基)10.4g，40mmoles)，Ac2O(3.77ml，40mmoles)和硫酸。將反應混合物加熱到50℃並在此溫度下保持90分鐘，然後冷卻到室溫並用水處理。將得到的沉澱過濾，使之懸浮於水中，用乙酸乙酯萃取三次。通過濃縮和加入正已烷從收集到的並脫水了的有機相中沉澱出8.12gZ-Gln(Trt)-OH(產率77%)。
HPLC〔梯度(Ⅱ)(230nm)〕r.t.11.3分鐘;純度100%。
B)往在A)中得到的產物(4g，7.6mmoles)溶於二氯甲烷(50ml)形成的溶液中加入三氟化硼合乙醚(153ul)和N-叔丁基-2，2，2-三氯乙醯亞胺TBTA;4.2g，15mmoles)。10分鐘後用飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌一次反應混合物，然後脫水蒸發至乾燥。所得殘留物溶於甲醇(60ml)，通過加入水而沉澱出3.5gZ-Gln(Trt)-OtBu(產率81%)。
HPLC〔梯度(Ⅱ)(230nm)〕r.t.17.7分鐘;純度100%。
C)B)中化合物(2.5g，4.3mmoles)溶於200ml甲醇，用N2保護，加入用甲酸活化的海綿狀鈀和一種甲酸銨溶液(200mg於5ml中)。3小時後濾除催化劑，蒸發甲醇溶液至乾燥。殘留物用乙酸乙酯溶解，用5%碳酸氫鈉洗一次，然後用水中和。使有機相脫水濃縮到較小體積，然後冷卻至0℃，用一當量HCl(於乙酸乙酯中)(4M，1.08ml)處理。連續添加石油醚沉澱出2gHCl·H-Gln(Trt)-OtBu)產率100%)。
HPLC〔梯度(Ⅱ)(230nm)〕r.t.7.4分鐘;純度100%。
D)將Z-Pro-OH(1.15g，46mmoles)溶於二氯甲烷(15ml)中，加入溶於DMF(250ml)的HOTB(0.7g，5.5mmoles)。在水溶中往這種溶液中加入DCCI(0.95g，4.6mmoles)。15分鐘後將反應混合物濾入一個含C)中化合扔(2g，4.1mmoles)的燒瓶中，並用TEA(587ul，41mmoles)中和。18小時後蒸除溶劑，殘留物在乙酸乙酯和水之間分配，有機相用2%硫酸氫鉀，5%碳酸氫鈉洗滌，用水中和，然後在硫酸鈉中脫水。通過添加正己烷從已濃縮到小體積的有機溶液中得到2.6gZ-Pro-Gln(Trt)-OtBu(產率93%。
PHLC〔梯度(Ⅱ)(230nm)〕r.t.16.8分鐘;純度100%。
E)象在C)中一樣，用海綿狀鈀和甲酸在100ml甲醇中氫化D)中被護的二肽(2.4g，3.5mmoles)。濾除催化劑並蒸除甲醇後，殘留物用乙酸乙酯溶解，用5%碳酸氫鈉洗一次並脫水。在0℃，濃縮的有機相用HCl(於乙酸乙酯中，4M，875ul)處理，通過添加石油醚得到2gHCl·H-Pro-Gln(Trt)-OtBu(產率100%)。
HPLC〔梯度(Ⅱ)(230nm)〕r.t.7.8分鐘;純度100%。
F)住例2D)中得到的準三肽(1.38g，2.26mmol)溶於二氯甲烷(15ml)形成的溶液中加入溶於200ulDMF的HOBT(382mg，2.82mmoles)。將溫度調至0℃，加入DCCI(466mg，2.26mmoles)。15分鐘後將混合物直接濾進一個含E)中二肽(1.31g，2.26mmoles)的燒瓶中，用TEA(318ul，2.26mmoles)中和並放置應過夜。蒸除溶劑後殘留物在乙酸乙酯和水之間分配，有機相用2%硫酸氫鉀，5%碳酸氫鈉洗滌，用水中和，然後在硫酸鈉中脫水。蒸發有機相至乾燥，然後用乙酸乙酯/正已烷(11V/V，15ml)溶解，通過加入正已烷得到23gMNP-gThr(tBu)-(R，S)mLys(Boc)-Pro-Gln(Trt)-OtBu(產率92%)。
HPLC〔梯度(Ⅱ)(230nm)〕r.t.21.5和22.0分鐘(兩個非對映立體異構體);純度92.5%。
G)將F)中逆轉化的四肽(2.13g，1.87mmoles)在室溫下溶於二氯甲烷/TFA(11V/V，40ml)中。90分鐘後蒸除溶劑，加入乙醚粗產物沉澱出來。這樣得到1.416gMNP-gThr-(R，S)mLys-Pro-Gln-OH(產率95%)。
HPLC〔梯度(Ⅰ)(230mn)〕r.t.12.4分鐘;純度91.5%。
胺基酸組成Pro(1)ho;Gln(1)1.0;NH3(3)2.9;肽含量92.7%。被保護的逆轉化的二肽在一個Dynamax柱(300 C18，12um，21.4×300mm)上通過RP-DC提純。以BDDA-Br(50mM於水中，0.1%TFA)作置換劑，流量為2.7ml/min。這樣得到1.04g產物(產率81%)。
HPLC〔梯度(Ⅰ)(230nm)〕r.t.12.4分鐘;純度100%。
在A的0～20%梯度(20分鐘)中r.t.17.5和17.8分鐘(兩個非對映立體異構體);純度100%。
H)將G)中被保護的逆轉化的四肽溶於15ml甲酸銨的水溶液(0.25M，PH3.0)中，加入用甲酸銨(0.5M，PH3.0)活化的海綿狀鈀，在60℃放置反應15分鐘。重複這種處理四次，升高反應溫度到70℃，直到HPLC顯示起始化合物消失。然後濾除催化劑，用乙醚洗滌水相，凍幹。粗產物在一個CM-SephadexC-25的PharmaciaXK26柱(26×300mm)上通過離子交換提純。以0.015M，PH6.0乙酸銨(A)和0.3M，PH6.0乙酸銨(B)作洗脫液，以0-100%B的線性梯度(360分鐘)，以4ml/min的流量洗脫。收集到3.7ml級分。凍幹那些顯示含有標題產物的級分。
HPLC〔梯度(Ⅳ)(230nm)〕r.t.6.5和7.7分鐘(比率為1∶1的兩個非對映立體異構體);純度99%。胺基酸組成Pro(1)1.0;Gln(1)1.0;NH3(3)2.9;肽含量966umoles(515mg);產率88%。
1H-NMR(200MHz;DMSO)d(0.5H;NHT)8.26;d(0.5H;NHT)7.99;d(0.5H;NHQ)7.49;s(1H;N Q)7.31;d(0.5H;NαQ)7.04;s(1H;NαQ)6.67;m(1H;CαT)4.31;m(1H;CαP)4.22;m(2H;CαQ;CδP)3.83÷3.70;m(3H;CβT;CαK;Cδ′P)3.64÷3.34;m(2H;CεK)2.74;m(8H;CβP;CβK;Cβ e CτQ)2.17÷1.66;s(6H CH3COOH)1.85;m(6H;CτP;Cτe CδK)1.64÷1.12;t(3H;CτT)1.04.
我們測試了代表本專利的一些化合物的生物活性。
在玻璃試管內老鼠脾細胞對IFN-t產生的刺激脾細胞以單一細胞懸浮液形式從BALB/C老鼠脾臟中獲得。如此得到的脾細胞重新懸浮於RPMI1640培養基中(FLow Lab.，Hertz，UK)。這種培養基含5%的最終濃度為107個細胞/ml的胎兒小牛血清(Hyclone，ST，Utah，USA)。在所示濃度的被測試化合物存在下於37℃將這些脾細胞在96腔培養皿中培養24小時。培養完後收集上層清液，用22um過濾器過濾，冰凍至-80℃直到用ELISA商用儀器(Genzyme，Boston，MA，USA)進行測試。
結果陳述於表1。
表1劑量(μg/ml) U/ml(刺激指數)Ex.1 Ex.2 Ex.30(基準) 31 31 410.1 33(1.1) 57(1.8) 60(1.5)1.0 60(1.9) 52(1.7) 60(1.5)10.0 49(1.6) 60(1.9) 68(1.7)所得相對於基準(未處理細胞)的U/ml和刺激指數(IS)結果表明本發明的化合物能用老鼠脾細胞對IFN-τ產生依賴劑量地刺激。特別地，例1的化合物是本類化合物中最有效的實際上它能以1.6μg/ml的劑量使已討論過的胞質分裂翻一番。
老鼠腹膜巨噬細胞對IL-1產生的刺激老鼠腹膜巨噬細胞按如下獲得在殺死動物前三天將水解澱粉溶液(BDH Chemicals，Poole，Dorset，UK)注入BALB/C鼠的腹腔中。然後用一種含10%FCS的RPMI1640溶液洗腹腔收集腹膜細胞，以106個細胞/ml的濃度重新懸浮於相同溶液中，置入96腔培養皿中。在所討論的化合物存在下於37℃培養96小時。處理完後收集上層清液，將之用於通過一種合適的ELISA商用儀器(Genzyme，Boston，MA，USA)測定劑量胞質分裂。
結果陳述於表2。
表2劑量(μg/ml) U/ml(刺激指數)Ex.1 Ex.2 Ex.30(基準) 15 15 150.01 6(0.4) 90(6.0) 150(10.0)0.1 2(0.1) 60(4.0) 160(10.7)1.0 2(0.1) 47(3.1) 155(10.3)10.0 2(0.1) 50(3.3) 140(9.3)所得相對於基準的U/ml和IS結果揭示實驗化合物表現出顯著的刺激效應。特別是例3的化合物在所有使用劑量下使IL-1的產生增加10倍(93＜IS＜10。7)。
老鼠腹膜細胞對氧化氮的刺激腹膜細胞按以上所述實驗方法獲得，在所討論合物和濃度為30μg/ml的脂多糖存在下於37℃培養96小時。處理完後收集上層清液，用Palmer R.M.J.等在Nature，327，524(1987)中所描述的化學發光實驗測定氧化氮含量。
結果陳述於表3。
表3劑量(μg/ml) nmol/ml(刺激指數)Ex.1 Ex.2 Ex.30(基準) 20 20 200.01 43(2.2) 85(4.3) 50(2.5)0.1 59(3.0) 61(3.1) 60(3.0)1.0 77(3.9) 66(3.3) 66(3.3)10.0 57(2.9) 79(4.0) 88(4.4)所得相對於基準的nmol/ml和刺激指數結果表明本發明的化合物在所有使用劑量下都能刺激氧化氮的產生。特別是例2的化合物在0.01ug/ml(IS＝4.3)表現出一個刺激峰。
老鼠腹膜巨噬細胞對利什曼原蟲活性的影響將按上法收集的腹膜細胞以105/100ul的濃度種入96腔圓底培養皿(Nune，Roskiled，DK)中，於37℃培養24小時，處理完後，分離並放出沒有粘附於腔壁的細胞，而粘附的細胞用培養基冼三次，並和所討論化合物一起培養24小時，然後通過用Leishmania major(Dr.Neal R.A.所提供的L.major，PVL49菌種，London School of Hygiene and Tropical medicine，London，UK)的promastigotes培養24小時而使細胞感染。感染處理完後往各腔中加入100ul0.01%的十二烷基硫酸鈉的RPMI1640溶液，培養皿於37℃培養30分鐘。加入含30%FCS的Schneider氏培養基(Sehneider Drosophila medium，GibcoLab.，Grand island，New York，USA)。各腔中加入1uCi3H-胸腺嘧啶脫氧核甙，於37℃培養72小時。由腹膜細胞裡的活寄生菌引入的放射活性與感染程度有關，所以還與細胞的利什曼原蟲活性有關。這种放射活性的引入量通過用細胞採集器收休細胞和用液體閃爍β-計數器測量放射活性而測定。
結果示於表4。
表4劑量(μg/ml) CPm*(感染降低%)**Ex.1 Ex.2 Ex.30(基準) 18,273 18,273 18,2730.1 5,096(72) 17,568(4) 18,826(-3)1.0 3,783(79) 11,991(34) 8,377(57)10.0 4,292(77) 10,582(42) 7,842(57)＊每分鐘計數＊＊＝100-〔 (處理的細胞cpm)/(基準細胞cpm) ×100〕所得結果表時本發明的化合物能降低感染程度。特別地，例1的化合物是最有效的，它實際上以在實驗中所用的最小劑量提供了超過70%的感染降低。
在體內對抵抗敗血症休克的評價把50mg/kg的LPS(-脂多糖)從腹膜內注入重20到25g的BALB/C鼠中(6個老鼠/組)。除基準外，其它各組在LPS注入後的0(即和LPS一起注入)或30分鐘內被注入漸增量的本發明的化合物之一。這些化合物溶於生理溶液中，最終體積為0.5ml。老鼠被檢查8天以測定其存活百分數。例1的化合物以6.2ug/鼠和0.62ug/鼠的劑量得到約65%的存活百分率，而它的異構體B以6.25ug/鼠的劑量得到約80%的存活百分率，以62.5ug/鼠的劑量得到的存活百分率為75%。
由以上所述的看來，本發明的化合物在所有病理和非病理情況下均有用。在這病理和非病理情況下，它能增強或恢復治病和預防中的免疫響應。所以作為本化合物用途的實例，在這裡可以援引細菌感染，主要在敗血症休克中;病毒感染(皰疹);寄生蟲病;由獲得性免疫缺乏綜合症、青老年預防、嚴重燒傷、透析、腫瘤和移植引起的感染。此外本發有的化合物可用作疫苗的輔助劑。
本發明還有一個目的是這種新的化合物(包括含本發明化合物的藥物組合物)作為免疫刺激劑的使用以及與所說用途有關的所有工業方面應用。對於設想中的醫療用途，結構式Ⅰ的化合物可按「Remington′s Pharmaceutical Sciences Handbook」，Mark Pub.Co.，XVIIed.，N.Y.USA中所述以適當配製的藥物組合物供給。顯然劑量取決於幾個方面，如被處理病例的種類和嚴重性以及患者的條件(重量、年齡、性別等)。
權利要求
1.結構式Ⅰ的逆轉化的四肽，及它的非對映應體異構體形式和它的藥理上
其中R是一個氫原子或蘇氨酸的側鏈；R1是精氨酸、亮氨酸或穀氨酸醯胺的側鏈；R2是一個氫原子或一種代謝上不經久的醯基基團，當R1是精氨酸的側鏈時，R不可能是蘇氨酸的側鏈。
2.根據權利要求1的四肽為gGly-(R，S)mLys-Pro-Arg和單個的非對映立體異構體形式。
3.根據權利要求1的四肽為gThr-(R，S)mLys-Pro-Leu和單個的非對映立體異構體形式。
4.根據權利要求1的四肽為gThr-(R，S)mLys-Pro-Gln和單個的非對映立體異構體形式。
5.根據權利要求1的逆轉化的四肽作免疫調節物質，在預防中和治療敗血症休克中的有用的試劑。
6.藥物組合物，它包括用於免疫調節和在預防及治療敗血症休克時的有效量的根據權利要求1的至少一種四肽。單獨使用或與一種藥理上可接受的賦形劑結合使用。
全文摘要
C-反應性蛋白質片斷的部分改性的和逆轉化的四肽類似物。具有免疫調節活性的C-反應性蛋白質片斷的逆轉化的四肽類似物。
文檔編號C07K5/02GK1078476SQ93104449
公開日1993年11月17日 申請日期1993年4月14日 優先權日1992年4月16日
發明者A·S·維迪尼, M·皮諾裡, S·卡佩萊蒂, L·蓋澤羅, F·萊尼 申請人:伊塔爾法馬科聯合股份公司