16SrⅡ組植原體PCR檢測試劑盒及其檢測方法

2023-08-07 04:31:46

專利名稱：16SrⅡ組植原體PCR檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種植原體PCR檢測試劑盒及其檢測方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
植原體(phytoplasma)(原稱類菌原體Mycoplasma-like Organism，簡稱MLO)是一類無細胞壁，存在於植物篩管細胞內的原核生物。植原體自1967年被日本學者土居養二首次發現後，迄今為止，世界上報導的植物植原體病害多達300餘種。由於植原體嚴格寄生於寄主植物韌皮部，不能進行人工培養，因而對其遺傳本質、生化特性、營養要求等都無從得知，同時對其檢測及鑑定技術的發展也受到阻礙。早期對植原體的鑑定主要是通過生物學特性，如症狀特徵、與昆蟲介體的相互關係等進行的。這些方法費時費力，結果往往也不是很可靠。80年代，隨著血清學、分子探針以及PCR技術的發展應用，為植原體的檢測提供了一種相對簡單、靈敏、可靠的方法。通過對植原體進化過程中相對保守基因(16SrRNA基因或核糖體蛋白基因)的序列分析或擴增產物的RFLP分析，可對植原體進行鑑定和分類，同時也建立了植原體的分類體系。
根據植原體16SrRNA基因及核糖體蛋白基因的RFLP分析，已將植原體分為14個確定組，即16SrI，16SrII……16SrXIV。其中16SrII組以花生叢枝病為代表，主要包括花生叢枝、甘薯叢枝、酸橙叢枝、蠶豆變葉、甘薯小葉及仙人掌叢枝等。
根據植原體16SrRNA基因序列，目前已設計出很多針對植原體組的特異引物，其中包括16SrI組、16SrIII組、16SrV組、16SrVI組、16SrVII組、16SrX組等，這些組的特異引物是根據組成各個組的植原體成員的16SrRNA基因保守區域設計的，顯然特異引物就不能對16SrII組的植原體進行直接鑑定。

發明內容
本發明的目的克服了現有技術的不足，提供了一種快速、準確、靈敏、特異性高、操作方便的專門用於16SrII組植原體的檢測試劑盒和使用方法。
本發明的技術方案為一種16SrII組植原體的PCR檢測試劑盒，包括以下成分(1)植原體16SrRNA基因通用引物序列R16mF25』-CATGCAAGTCGAACGGA-3』R16mR15』-CTTAACCCCAATCATCGAC-3』(2)16SrII組植原體的特異引物序列
R16(II)F15』-AGTGGCGAACCATTTGTT-3』；R16(II)R15』-CTCGAATAAACGAGTTAGG-3』(3)試劑盒反應體系含有10×PCR反應緩衝液、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
試劑盒反應體系各試劑終濃度為1×PCR反應緩衝液，2.0mM MgCl2，0.2mMdNTPs，0.6μM R16mF2/R1引物(或R16(II)F1/R1)及4-5個單位的Taq DNA聚合酶。
16SrII組植原體的PCR檢測方法(1)PCR反應在上述檢測試劑盒中加入0.1-1μg感病植株總DNA後，再加入超純水使反應總體積為50μl。然後進行PCR反應，反應參數為為95℃預變性5min；95℃變性30sec，60℃退火2min，72℃延伸3min，10個反應循環後加入引物R16(II)F1/R1並於95℃變性30sec，40℃退火2min，72℃延伸3min，10個循環後72℃保溫10min，4℃冰箱中保存。
(2)電泳檢測取5μl反應產物在0.7-1.0％的瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色後在凝膠成像系統上拍照觀察含有16SrII組植原體的樣品電泳檢測結果可觀察到1500bp和990bp的二條特異擴增條帶，而非16SrII組植原體的樣品電泳檢測結果只能觀察到1500bp的擴增條帶。
本發明提供的16SrII組植原體PCR檢測試劑盒及其檢測方法，與現有技術相比，具有以下優點和積極效果(1)具有較高的檢測靈敏度。在第一次PCR反應中，使用植原體16SrRNA基因通用引物經10次循環可擴增出植原體特異大片段，這些產物為第二次擴增提供了足夠的模板，這樣便大大提高了檢測的靈敏度。在加入了16SrII組的特異引物後，經10次反應循環便可通過電泳檢測是否有16SrII組的特異擴增產物。
(2)具有較高的擴增特異性。通常在PCR反應過程中，退火溫度高，擴增產物的特異性便會提高。在本試劑盒的使用方法中，使用植原體通用引物(R16mF2/R1)的第一次擴增反應中，為了提高植原體特異大片段的特異性，採用了較高的退火溫度(60℃)；而在第二次擴增反應中，則採用了較低的退火溫度(40℃)，但仍只擴增出了和引物設計相符的990bp的擴增小片段，這足以說明該反應試劑盒具有較高的特異性。
(3)能快速檢測植原體病害樣品，同時又可對屬於16SrII組的植原體進行分類鑑定。本試劑盒根據6種16SrII組和其它16Sr組植原體株系的16SrDNA序列比較結果，設計了一對針對16SrII組植原體PCR檢測的特異引物，經過二次PCR反應，即可同時檢測並鑑定16SrII組植原體。


圖1 16SrII組植原體特異引物循環PCR擴增條帶MDNA分子量標準；1CK；2-3分別為泡桐叢枝和桑樹黃萎，均為非16SrII組植原體樣品；4-5分別為花生叢枝和仙人掌叢枝，為16SrII組植原體樣品。
具體實施例方式
1、植原體16SrRNA基因通用引物序列的合成及配製參照Lee等人所報導的植原體16SrRNA基因通用引物對R16mF2/R16mR1序列合成引物，擴增長度約為1500bp。引物溶解於適量滅菌水中至終濃度為10μM。
2、16SrII組植原體PCR引物的設計、合成與配製根據6種16SrII組和其它16Sr組植原體株系的16SrDNA序列比較結果(圖1)，設計併合成與仙人掌叢枝病植原體CWB株系16SrDNA第416-433區段鹼基序列同源的上遊引物R16(II)F1及與第1387-1405區段鹼基序列互補的下遊引物R16(II)R1，擴增長度為990bp。引物溶解於適量滅菌水中至終濃度為10μM。
416 433 1387 1405↓ ↓ ↓↓CWBAGTGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGFBPAGTGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGWBDL AGTGGTGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTA.TCGAGPnWB AATGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGSUNHP AATGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGSPWB AATGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGWX AGT.G.GAAAAACTCCCT………………CCTAACTTCGCAAGA..AGLY AGT.G.GAAAAACTATCT………………CCTAACTGCGTAAGC..AGPPWB AGT.G.GAAAAACTATCT………………CCTAACTTCGTTAGA..AGEY1AGTGG.GAAAAACTATAT………………CTTAACTTCGCAAGA..AGCP AGT.G.GAAAAACTATAT………………CTTAACTTCGCAAGA..AGAshY AGT.G.GAAAAACTATCT………………CTTAACTTCGCAAGA..CGLfWB AGT.G.GAAAAACTATCT………………CTTAATTTCGTAAGA..AASAYGAT.G.GAAAAATCATTC………………CCTAACTTCGCAAG..AAGSTOL GGT.G.GAAAAACCATTA………………CCTAACTTGAGCAATCAAGAT GAT.G.GAAAAATCATTC………………CCTAACTTGCAA....AAG3、PCR試劑盒的組裝PCR反應各試劑按試劑盒反應體系配製。
4、16SrII組植原體PCR檢測試劑盒的檢測方法(1)PCR反應在上述PCR檢測試劑盒中加入0.1-1μg感病植株總DNA後，再加入超純水使反應總體積為50μl。然後進行PCR反應，反應參數為為95℃預變性5min；95℃變性30sec，60℃退火2min，72℃延伸3min，10個反應循環後加入引物R16(II)F1/R1並於95℃變性30sec，40℃退火2min，72℃延伸3min，進行10個循環後於72℃保溫10min。
(2)電泳檢測取5μl反應產物與1μl 6倍電泳上樣緩衝液混勻，在0.7-1.0％的瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色後在凝膠成像系統上拍照觀察。
實驗結果如下以泡桐叢枝病、桑樹黃萎病等2個非16SrII組植原體的總DNA為對照，按照試劑盒的使用方法檢測該試劑盒的特異性，結果表明以泡桐叢枝病、桑樹黃萎病等2個非16SrII組植原體的總DNA為模板的PCR，只擴增出約1.5kb的特異帶，而以花生叢枝及仙人掌叢枝等2個16SrII組植原體的總DNA為模板的PCR卻擴增出約1.5kb和約小於1.0kb的兩條混合條帶，其中約小於1.0k條帶與引物設計相符。說明該試劑盒有較高的特異性。
權利要求
1.一種16SrII組植原體的PCR檢測試劑盒及其檢測方法，其特徵是試劑盒包括以下成分(1)植原體16S rRNA基因通用引物序列R16mF25』-CATGCAAGTCGAACGGA-3』R16mR15』-CTTAACCCCAATCATCGAC-3』(2)16SrII組植原體的特異引物序列R16(II)F15』-AGTGGCGAACCATTTGTT-3』；R16(II)R15』-CTCGAATAAACGAGTTAGG-3』(3)試劑盒反應體系含有10×PCR反應緩衝液、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
2.根據權利要求1所述的16SrII組植原體的PCR檢測試劑盒及其檢測方法，其特徵在於所述的試劑盒反應體系各試劑終濃度為1×PCR反應緩衝液，2.0mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.6μM R16mF2/R1(或R16(II)F1/R1)引物及4-5個單位的Taq DNA聚合酶。
3.根據權利要求1所述的16SrII組植原體的PCR檢測試劑盒及其方法，其檢測步驟為(1)PCR反應在上述檢測試劑盒中加入0.1-1μg感病植株總DNA後，再加入超純水使反應總體積為50μl，進行PCR反應，反應參數為為95℃預變性5min；95℃變性30sec，60℃退火2min，72℃延伸3min，10個反應循環後加入引物R16(II)F1/R1並於95℃變性30sec，40℃退火2min，72℃延伸3min，10個循環後72℃保溫10min，4℃冰箱中保存；(2)電泳檢測取5μl反應產物在0.7-1.0％的瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色後在凝膠成像系統上拍照觀察含有16SrII組植原體的樣品電泳檢測結果可觀察到1500bp和990bp的二條特異擴增條帶，而非16SrII組植原體的樣品電泳檢測結果只能觀察到1500bp的擴增條帶。
全文摘要
本發明涉及一種植原體PCR檢測試劑盒及其檢測方法，專用於16SrII組植原體的檢測。試劑盒包括PCR常用反應試劑，主要有PCR反應緩衝液、MgCl
文檔編號C12Q1/68GK1824798SQ200510048729
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月22日 優先權日2005年12月22日
發明者蔡紅, 陳海如, 孔寶華, 範靜華, 李凡, 和志嬌, 劉濤, 楊根華 申請人:雲南農業大學