用於從固定組織樣品回收核酸或蛋白質的方法、組合物和試劑盒的製作方法
2023-08-07 17:23:56 1
專利名稱：用於從固定組織樣品回收核酸或蛋白質的方法、組合物和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明描述了用於改善已經固定在組織或者細胞樣品中的核酸或者蛋白質的回收的方法和試劑盒。
背景技術：
在組織學、病理學和細胞生物學領域，固定(fixation)為一種化學方法，通過該方法保存生物樣品以防腐爛。固定終止任何正在進行的生化反應，且也可增加待處理樣品的機械強度或者穩定性。固定的目的是儘可能以接近生物材料的天然狀態來保存該生物材料的樣品。固定樣品用於檢驗或者分析。浸沒(immersion)為一種固定技術，其中將樣品浸沒於體積最少為待固定組織體積20倍的固定劑中。固定劑擴散經過組織以固定，因此必須考慮組織的大小和密度以及固定劑類型。使用較大樣品表示固定劑需要較長時間來到達較深組織。固定劑可分類為交聯或者沉澱固定劑。交聯固定劑通過在組織中的蛋白質之間產生共價化學鍵來起作用。這將可溶性蛋白質錨定於細胞骨架，且向組織提供額外的剛性。沉澱或者變性固定劑通過降低蛋白質分子的溶解度且經常通過破壞疏水性相互作用來起作用，所述疏水性作用給予許多蛋白質三級結構。組織學上一種常用的固定劑為交聯固定劑甲醛，其通常作為飽和水溶液以福馬林為名出售。甲醛被認為主要與鹼性胺基酸賴氨酸的殘基相互作用。用於固定的另一種通用醛為戊二醛，其被認為以與甲醛類似的機理起作用。甲醛通過以下方法來保存或者固定組織或者細胞通過-CH2 -連接即亞甲基橋交聯蛋白質或者核酸中的伯氨基。由於甲醛是高反應性的，因此樣品或者培養基中過量的甲醛將妨礙任何涉及具有氨基的功能蛋白質(諸如酶或者抗體)、核酸探針、樹脂或者任何其它功能試劑的樣品加工或者分析，這是通過過量的甲醛與這些氨基交聯以及隨後使試劑失活來進行的。此外，由於交聯可通過加熱來逆轉，因此培養基中任何過量的甲醛將最終再次形成交聯，這阻止了有效的交聯逆轉。氧化固定劑可與各種蛋白質和其它生物分子的側鏈反應，這使得形成穩定組織結構的交聯。當製備樣品以用於電子顯微鏡術時，通常使用四氧化鋨作為第二固定劑。重鉻酸鉀、鉻酸和高錳酸鉀也用於特定組織學製品。兩種常用沉澱固定劑為乙醇和甲醇。也使用丙酮。乙酸為一種變性劑，其有時與其它沉澱固定劑組合使用。已知醇本身在固定過程中引起組織的收縮，而單獨的乙酸與組織溶脹相關；將以上兩者組合可導致組織形態更好地保存。其它固定劑包括苦味酸和氯化汞。固定生物樣品的一個問題是樣品中的核酸和蛋白質可能與一種或者多種固定劑進行不可逆地結合。即使核酸和蛋白質並未與一種或者多種固定劑進行不可逆地結合，但是從樣品中除去過量固定劑對於核酸和蛋白質的可靠回收和分析來說可能是重要的。此夕卜，固定劑可妨礙分離的蛋白質或者核酸在下遊生化分析諸如PCR中的使用。
發明內容
本發明涉及從固定生物樣品和物質中回收並分析靶標分子諸如核酸或者蛋白質的方法和可用於這種方法中的試劑盒。在一個實施方案中,本發明提供從保存於液體細胞防腐保存液(liquid cytologypreservative solution)中的生物樣品提取祀標分子的方法。
在一個實施方案中，所述方法包括:A)使生物樣品與包含清除劑(scavengingagent)的清除溶液(scavenger solution)接觸,所述清除劑包含至少一個下式的末端肼基
H-ΝΤ. 7.以及
1 5B)在足以使核酸或者蛋白質從生物樣品釋放的條件下處理所述生物樣品；和C)從分尚的溶液中回收祀標分子，其中所述祀標分子為核酸或者多肽。在一個實施方案中，所述清除劑選自a)式I的化合物
NH2 (R1)ln .NH2H(I)和NH ；b)式II的化合物
H
R1IR2-N—NH2)n (II)，其中R1選自=C1-C12烷基K1-C12烯基；C3_C6環烷基；C3_C6環烯基；C6_C1(I芳基；和
C6-Cltl雜芳基；R2在每種情況下可相同或者不同，且選自
O
IlO-1-和S
(i)——C——,( ) O (iii)——C——；m為選自O和I的整數；且η為選自I和2的整數。在某些實施方案中，所述清除劑可通過本領域已知的方法來修飾以增加清除劑在水中的溶解度。例如，R1可任選取代有增加R1成分的親水性的成分。在另外的實施方案中，所述清除劑為式I的化合物，其中m為I且R1選自(^-(12烷基、C1-C6烷基和C2-C4烷基。在另外的實施方案中，所述清除劑為式II的化合物，其中η為2，R1選自C1-C12烷基、C1-C6烷基和C2-C4烷基；且R2為
權利要求
1.從保存於液體細胞防腐保存液中的生物樣品提取靶標分子的方法，該方法包括 A)使所述生物樣品與包含清除劑的清除溶液接觸，所述清除劑包含至少一個末端肼基; B)在足以使核酸或者蛋白質從生物樣品釋放的條件下處理所述生物樣品；以及 O分離所述靶標分子。
2.權利要求I的方法，其中所述清除劑選自 a)式I的化合物
3.權利要求2的方法，其中所述清除劑為式I的化合物，其中R1為C1-C12烷基且m為1。
4.權利要求3的方法，其中R1為C1-C6烷基。
5.權利要求3或4的方法，其中R1為C2-C4烷基。
6.權利要求2的方法，其中所述清除劑為式II的化合物，其中R1為C1-C12烷基；R2為
7.權利要求6的方法，其中R1為C1-C6烷基。
8.權利要求6或7的方法，其中R1為C2-C4烷基。
9.權利要求I的方法，其中所述清除劑選自氨基脲；氨基硫脲；卡巴肼；硫代卡巴肼；N-氨基胍及其鹽；N，N-二氨基胍及其鹽；乙醯肼；己二酸二醯肼；琥珀酸二醯肼；甲醯肼；馬來酸二醯肼；丙二酸二醯肼；苯磺醯肼；甲苯磺醯肼；和甲磺醯肼。
10.權利要求I至9中任一項的方法，其中所述清除溶液包含約O.IM至約I. OM的所述清除劑。
11.權利要求I至10中任一項的方法，其中所述清除溶液包含約O.IM至約O. 5M的所述清除劑。
12.權利要求I至11中任一項的方法,其中所述清除溶液包含約O.2M至約O. 4M的所述清除劑。
13.權利要求I至12中任一項的方法，其中所述清除溶液包含約O.3M己二酸二醯肼或者約O. 3M琥珀酸二醯肼。
14.權利要求I至13中任一項的方法，其中所述清除溶液直接加至所述液體細胞防腐保存液。
15.權利要求I至14中任一項的方法，其中所述清除溶液進一步包含蛋白消化酶。
16.權利要求I至15中任一項的方法，其中在所述靶標分子從生物樣品釋放之前，使所述生物樣品與所述清除溶液接觸。
17.權利要求I至16中任一項的方法，其中通過在裂解溶液的存在下裂解所述生物樣品將所述靶標分子從生物樣品釋放。
18.權利要求17的方法，其中所述清除溶液為裂解溶液。
19.權利要求17的方法，其中在將裂解溶液加至生物樣品之前、之後或者同時將所述清除溶液加至生物樣品。
20.權利要求I至19中任一項的方法，其中所述靶標分子為靶標核酸且 C)所述靶標核酸通過以下方法來分離，所述方法包括 (i)使用第二核酸將核酸探針與所述靶標核酸雜交以形成核酸雜交物； ( )使所述核酸雜交物與固相結合； (iii)分尚所述固相；和 (iv)從所述固相洗脫所述靶標核酸。
21.權利要求20的方法，其中所述核酸雜交物為DNA= RNA雜交物且其中通過以下方法使所述DNA = RNA雜交物與固相結合，所述方法包括使所述核酸雜交物與能夠結合所述核酸雜交物的抗體接觸，其中所述抗體與所述固相結合或者適於與所述固相結合。
22.權利要求I至19中任一項的方法，其中所述靶標分子為靶標核酸且 C)所述靶標核酸通過以下方法來分離，所述方法包括 (i)使所述靶標核酸與陰離子交換基質結合；和 ( )從所述陰離子交換基質洗脫所述靶標核酸。
23.權利要求22的方法，其中所述靶標核酸在約20°C至約70° C的洗脫溫度從所述陰離子交換基質洗脫。
24.權利要求22或23的方法，其中所述靶標核酸在約50°C至約60° C的洗脫溫度從所述陰離子交換基質洗脫。
25.裂解溶液，包含 ⑴緩衝劑； ( )洗滌劑； (iii)包含至少一個末端肼基的清除劑；且 (iv)任選的蛋白消化酶。
26.權利要求25的裂解溶液，其中所述清除劑選自 a)式I的化合物
27.權利要求25或26的裂解溶液，其中所述清除劑選自氨基脲；氨基硫脲；卡巴肼；硫代卡巴肼；Ν-氨基胍及其鹽；N，N- 二氨基胍及其鹽；乙醯肼；己二酸二醯肼；琥珀酸二醯肼；甲醯肼；馬來酸二醯肼；丙二酸二醯肼；苯磺醯肼；甲苯磺醯肼；和甲磺醯肼。
28.權利要求25至27中任一項的裂解溶液，包含約O.IM至約I. OM的所述清除劑。
29.權利要求25至28中任一項的裂解溶液，包含約O.IM至約O. 5Μ己二酸二醯肼或者約O. IM至約O. 5Μ琥珀酸二醯肼。
30.試劑盒，其用於從保存於液體細胞防腐保存液中的生物樣品回收靶標核酸，所述試劑盒包含權利要求25至29中任一項的裂解溶液且任選包含至少一種選自下述的額外組分蛋白消化酶、固相、能夠與所述靶標核酸雜交的核酸探針，以及抗體。
全文摘要
本發明提供通過採用清除分子諸如含有肼和含有醯肼的化合物來改善核酸或者蛋白質從保存於液體細胞防腐保存液中的樣品中回收的方法和物質。本發明也提供包含含有肼和含有醯肼的化合物的裂解溶液以及包含所述化合物的試劑盒。
文檔編號C12N15/10GK102803490SQ201180012414
公開日2012年11月28日 申請日期2011年1月4日 優先權日2010年1月4日
發明者Y.科裡平, A.弗馬尼, L.科巴亞希 申請人:奇亞根蓋瑟斯堡股份有限公司