一組陽離子抗菌肽及其製備方法和應用的製作方法
2023-08-09 10:46:56 1
專利名稱：一組陽離子抗菌肽及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥領域，具體而言涉及ー組具有廣譜抗菌活性的陽離子抗菌肽及其製備方法和應用。
背景技術：
自從青黴素發現以來，抗生素一直是人類治療病原微生物感染的有力武器，但隨著傳統抗生素的濫用，越來越多的病原菌開始對傳統抗生素產生耐藥性，所以急需尋找一類全新的抗菌藥物來替代抗生素進行使用。陽離子抗菌肽(cationic antimicrobial peptides)是植物和動物產生的一般由12-50個胺基酸殘基組成的陽離子型(富含精氨酸及賴氨酸)多肽，能夠保護宿主不受外界病原微生物感染。陽離子抗菌肽的抗菌譜比傳統抗生素寬，來自昆蟲、豬、蛙以及人的陽離 子抗菌肽不僅對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌有抗菌作用，而且還具有抗真菌及抗病毒活性。傳統抗生素通過消除微生物生長或生存必不可少的條件，如使酶變性，來達到殺菌的目的，但細菌只要ー種基因突變後就可以抵抗此類抗生素的攻擊。而陽離子抗菌肽則通過中和電荷的方法與細菌細胞膜相互作用，以此穿透殺死細菌，極大地減少了細菌產生耐藥性的可能。但天然的陽離子抗菌肽並非完美無缺，部分抗菌肽對真核生物有一定的毒性，對病原物高殺滅活性的同時往往伴隨著對真核生物的溶血作用。因此如何提高其活性並最大程度降低其毒性是目前抗菌肽藥物開發的難點和希望所在。目前的研究主要將a-螺旋的兩性抗菌肽作為研究對象，圍繞陽離子胺基酸以及疏水性胺基酸數量及位置，對抗菌肽進行結構改造，如殘基替換、截取天然抗菌肽的部分序列以及增加肽鏈的正電荷含量等，取得了較大進展。Yanga等研究了富含精氨酸和脯氨酸的抗菌肽Tritrpticin,他們將抗菌肽胺基酸序列中精氨酸替換為賴氨酸，發現雖然兩者的構象沒有顯著的差別，但替換後的抗菌肽活性提高了 2倍而且溶血活性大大降低。Shin等將CecropinA的N端8個殘基作頭，Magainin2的N端12個殘基作尾，合成得到了雜合鏈CecropinA (I 8) _magainin2 (I 12)(縮寫CE-MA)，發現其表現出很強的抗細菌活性，且沒有溶血性。Fernandez等通過交替D和L型胺基酸,合成了一系列含有偶數殘基的短肽。通過抑菌(S. aureus和E. coli)試驗，得到僅有8個殘基的a螺旋肽鏈(KQQRWLWLW)具有強抑菌作用。Subbalakshmi等人工合成了 Melittin的C端15個胺基酸殘基(MCF) ,MCF包含了 Melittin的大部分兩親片段，而且抗菌活性比Melittin高5 7倍，而溶血活性低300倍。Ahn等截取並不具抗菌活性的Tenecinl的螺旋區域，用Lys替代其中的Asp和His得衍生肽L4，正電荷數由2增至5，使L4展示出很強的抗菌活性，且無溶血性。美國專利US006040291A 設計了序列為(或包含)Lys-Xal-Phe-Lys-Arg-Ile-Val-Xa2-Phe-Ile-Xaa-Xa2-Phe-Leu-Arg-Xa2-Leu-Val 的一系列陽離子抗菌妝，其中 Xal 代表疏水性胺基酸殘基，Xa2代表親水性胺基酸殘基，Xaa代表任意胺基酸殘基。體內外試驗表明，此系列抗菌肽具有較高的抗菌活性。
美國專利US20050277589A1公布了一組序列為(KLAKLAK)n ( P xx P )m的抗菌肽序列，其中0代表鹼性胺基酸殘基，X代表任意胺基酸殘基，PxxP為4-15個胺基酸殘基組成的帶正電荷的序列。m和n代表1-5之間的任一數值。體外實驗表明，該系列化合物具有廣譜抗菌活性。中國專利CN 101319007A設計的一條序列為將牛乳鐵蛋白LfcinB15中第4位的精氨酸和第10位的甲硫氨酸替換為色氨酸，新抗菌肽對革蘭氏陽性菌具有較強的抑制活性。中國專利CN 1363558A公布了一組蛙皮抗菌肽素的衍生物及其適合於藥用的鹽，其序列 Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Phe-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-X-Asn-Y-OH,其中,X為選自Met、Ile或Leu的胺基酸殘基，Y為選自Ser、Lys> lie、Arg、Leu的兩個胺基酸殘基的組合。研究表明，此衍生物和天然蛙皮抗菌肽的活性相當，但安全性更優。
發明內容
本發明涉及一組多肽，其胺基酸序列為X-(C)m- n-His-X，其中X為Cys或缺失，當X為Cys時，該肽可以形成環肽；(為Leu、lie、Nle、Val、Trp, Phe, D-Phe或Thi ；B為Lys、D-Lys、Arg、D-Arg 或 HoR ;m 與 n 為 6-8 中的任一值。作為本發明的一個優選方案X優選以缺失的形式存在；C優選Phe、Leu或Trp，m=6 ；B 優選 Lys 或 Arg, n = 7。 作為本發明的另一個優選方案X優選以缺失的形式存在；C選自Phe、Leu*Trp，m 為 6 ; (B)n 為 Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys。本發明所涉及的胺基酸殘基既包括天然胺基酸，也包括非天然胺基酸。本發明所涉及的天然胺基酸所對應的三字母代碼表如表I所示，本發明所涉及的非天然胺基酸所對應的三字母代碼表及結構如表2所示。本發明所涉及的所有胺基酸殘基若不特別限定其構型，代表L型胺基酸。本發明所涉及的多肽為線性肽時，其C末端既可以是羧酸的形式，也可以是醯胺的形式，優選以醯胺的形式存在。表I :天然胺基酸三字母代碼表
權利要求
1.多肽或其藥用鹽，所述多肽通式為x-(C)m- n-HiS-X其中X為Cys或缺失；C 為 Leu、Ile、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe 或 Thi ；B 為 Lys、D-Lys、Arg、D-Arg 或 HoR ；m與n為6-8中的任一值。
2.根據權利要求I所述的多肽，其特徵在於多肽為線性肽或環肽。
3.根據權利要求2所述的線性肽，其特徵在於多肽C末端為羧酸的形式或醯胺的形式。
4.根據權利要求2所述的環肽，其特徵在於X為Cys且形成分子間二硫鍵。
5.權利要求3所述線性肽的製備方法，步驟為 (1)在樹脂上固相合成多肽； (2)將步驟(I)的產物在三氟乙酸或氫氟酸中進行裂解，加入側鏈保護基清除劑；並與5-20倍體積比的冰乙醚混合，沉澱多肽，離心，乾燥得到粗肽。
6.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於步驟(I)是在液相環境中進行，具體包括浸泡樹脂-脫除氨基保護基-洗滌-偶聯胺基酸-監測-洗滌-脫除氨基保護基(順序連接其餘胺基酸)-乾燥樹脂。
7.權利要求3所述線性肽的純化方法，其特徵在於採用反相色譜法或離子交換色譜法。
8.權利要求4所述環肽的製備方法，步驟為 (1)製備線性肽； (2)雙氧水氧化法在線性肽的基礎上製備環肽。
9.權利要求4所述環肽的純化方法，其特徵在於採用反相色譜法或離子交換色譜法。
10.權利要求1-4所述的多肽在製備抗細菌及抗真菌藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於醫藥領域，具體而言涉及一組具有廣譜抗菌活性的陽離子抗菌肽及其製備方法和應用。本發明所涉及的陽離子抗菌肽的胺基酸序列通式為X-(C)m-(B)n-His-X。
文檔編號C07K7/08GK102766196SQ20111011664
公開日2012年11月7日 申請日期2011年5月6日 優先權日2011年5月6日
發明者馮軍, 吳勇, 張喜全, 徐宏江, 朱裕輝, 楊潔, 路建光 申請人:上海醫藥工業研究院, 江蘇正大天晴藥業股份有限公司