一種大黃素注射製劑及其製備方法

2023-07-12 10:41:46

專利名稱：一種大黃素注射製劑及其製備方法
技術領域：
本發明屬於中藥製藥技術領域，具體涉及大黃素注射製劑及其製備方法。
背景技術：
大黃素是一種蒽醌類物質，主要存在於蓼科、鼠李科等植物中，是大黃、首烏、虎杖等中藥的有效成分，也是一類重要的天然色素。藥理實驗表明大黃素具有抑制胰酶活性、抗炎、抑菌、免疫調節、保護肝腎、利膽、抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集、抗腫瘤等多種作用。以大黃、首烏、虎杖為君藥，以大黃素為主要有效成分的製劑應用十分廣泛，而大黃素尚未有用於臨床的報導。大黃素藥理活性廣泛，毒副作用少，藥源豐富，隨著對其藥理作用的深入研究，大黃素良好的臨床應用前景將逐漸顯露。
目前有以大黃素為主要有效成分的大黃注射液的研究報導，但未見大黃注射液的銷售，可能與下列因素有關大黃素是強疏水性物質，溶於有機溶媒而幾乎完全不溶於水；大黃素對溼、熱不穩定[蘇子仁等.大黃在提取精製工藝中的化學成分變化研究.藥物分析雜誌.1998，18(2)85]。上述因素使製備及貯存注射製劑存在較大困難。
β-環糊精(簡稱β-CD)是一種新型的藥物包合材料，具環狀中空筒型，環外親水、環內疏水的特殊結構和性質。利用β-CD特殊的結構和性質，可以將不溶於水的藥物分子包結，增加藥物的溶解度和穩定性。在歐洲和日本已有西藥的β-CD包合物產品上市，β-CD已載入美國、日本和中國藥典。一般認為藥物分子的溶解度越小，β-CD包合物的增溶作用則越大，如齊墩果酸的β-CD包合物可使它的溶解度提高12倍，累積溶出率增大6倍[顏耀東等.齊墩果酸-β-環糊精包合物的研究.中成藥，1995，17(6)4]。β-CD只是CD中溶解度最小的一種經結構修飾後其溶解性大大提高，如羥烷基化β-CD衍生物，羧基β-CD衍生物等，環糊精在藥物製劑中的應用將越來越廣泛。

發明內容
針對大黃素具有廣泛的藥理作用，但由於其結構特點和化學性質的限制，缺乏製備可靠的大黃素注射製劑方法的現象，本發明通過將大黃素與複合劑複合，形成了大黃素與複合劑的複合體，增加了大黃素在水中的溶解度及製劑的穩定性，使大黃素在水中的溶解度由＜2.5×10-6mol/l(幾乎不溶於水)提高到3×10-6～2×10-5mol/l，在此基礎上製備成大黃素注射製劑，特別是製成靜脈注射劑，包括不同容量的注射液和凍乾粉針劑，為臨床應用提供了一種穩定性好、質量高、療效顯著的大黃素注射製劑，本發明還公開了大黃素注射製劑的製備方法。
本發明是通過以下技術方案實現的。
1在40～80℃水浴中，以適量蒸餾水溶解複合劑。
(1)複合劑為易溶於水的帶有多羥基的大分子物質，包括改性澱粉、糊精、環糊精。
(2)優選複合劑為帶有結合基團的β-CD。
(3)最佳複合劑為羥丙基β-CD。
2大黃素用70～95％的乙醇溶解。
3在40～80℃水浴保溫並攪拌狀態下，將大黃素乙醇溶液緩慢加入複合劑溶液中，恆溫攪拌0.5～2h，得大黃素與複合劑的複合體溶液。
(1)大黃素與複合劑的摩爾比為1∶1～1∶10(2)大黃素與複合劑的摩爾比優選為1∶1～1∶3(3)大黃素與複合劑的摩爾比最佳為1∶24向大黃素與複合劑的複合體溶液中加入適量注射劑用水溶性藥用輔料，攪拌使溶解，再補充適量注射用水，攪勻，過濾、分裝、滅菌、包裝即得本發明的大黃素注射製劑的輸液劑。
注射劑用水溶性藥用輔料為氯化鈉、葡萄糖中的一種。
5將步驟4加入適量注射劑用水溶性藥用輔料攪拌溶解後的複合體溶液，加入凍幹賦形劑，經過濾、分裝，冷凍乾燥，即得本發明的大黃素注射製劑的凍乾粉針劑。
(1)凍幹賦形劑可以是任意常用的凍幹賦形劑。
(2)優選凍幹賦形劑為甘露醇、乳糖、蔗糖、或葡萄糖中的一種或兩種的複合賦形劑。
本發明通過將大黃素與複合劑複合，製成的大黃素注射製劑可用於癌症、肝病、腎病等的治療。實驗證明，本發明的一種大黃素注射製劑穩定性好、質量高、療效顯著。
下面通過實驗對本發明的一種大黃素注射製劑作進一步的說明。
實驗一對本發明的大黃素注射液的穩定性考察1實驗材料 大黃素注射液100ml∶40mg，廣東天之驕藥物開發有限公司實驗室提供。
2實驗方法與結果 取3批樣品，每批50瓶，室溫放置，間隔一定時間檢查含量、澄明度合格率，結果見表1。
表1放置時間對大黃注射液穩定性的影響批號 020619 020903 0212207放置時間(月)0 6 12 0 6 120 6 12澄明度合格率(％)10010096 10098 9810010098含量(μg/ml)400398396398398396 400398395實驗二大黃素注射液的體外溶血實驗及血管刺激實驗1實驗材料 大黃素注射液100ml∶50g，廣東天之驕藥物開發有限公司實驗室提供；家兔，8隻，由第一軍醫大學實驗動物中心提供，體重1.7～2.2kg。
2實驗方法與結果2.1溶血實驗家兔頸動脈取血，去纖維蛋白原，加約10倍於血液的生理鹽水洗滌離心，去上清液，反覆數次，至上清液不現紅色為止，以生理鹽水稀釋成2％的紅細胞懸液。取潔淨試管12支，分為2組，依次編號，按表2所列先在各管加入2％兔紅細胞懸液及生理鹽水混勻，置37℃恆溫箱中30分鐘後，各管加入不同量的大黃素注射液(第1、7號管為對照不含大黃素)，搖勻後再置37℃恆溫箱中，於15、30、60、120、180、240分鐘各觀察一次，若溶血則溶液呈透明紅色，如有棕色沉澱，表示有紅細胞凝聚作用，搖動數次後消失為假凝聚，否則為真凝聚。
實驗結果見表2。結果顯示大黃素注射液在高劑量和低劑量情況下均未有溶血和引起紅細胞凝聚的作用。
表2大黃素注射液溶血實驗試管號試劑類別與劑量12345678910 11 122％紅細胞懸液(ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5生理鹽水(ml)2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0大黃素注射液0.2mg/ml(ml)00.1 0.2 0.3 0.4 0.5大黃素注射液0.4mg/ml(ml) 00.1 0.2 0.3 0.4 0.5溶血------------紅細胞凝聚 -------------表示無溶血或紅細胞凝聚2.2血管刺激實驗取家兔6隻，分為2組，每組3隻，一組各兔右耳耳緣靜脈注射大黃注射液0.8mg/kg(相當於臨床日用量)，另一組各兔右耳耳緣靜脈注射等量生理鹽水，每日一次，連續給藥3天，末次給藥後1h處死動物，取各兔耳距針眼5mm左右的上下各一段(約1.0×0.5cm)帶有靜脈的耳片，作病理切片進行組織學觀察，檢查有無血管充血，組織變性、壞死等顯著的刺激反應。
兔耳片經病理組織學光鏡檢查，大黃素注射液組的6片耳片可見血管擴張，血管周圍有紅細胞，毛囊周圍有少量白細胞浸潤，而生理鹽水組的耳片組織學檢查均見血管周圍有少量紅細胞，兩組耳片均未見血管壁變性、壞死，管腔內亦無血栓形成等改變。
實驗三大黃素注射液的急性毒性實驗及過敏實驗1實驗材料 大黃素注射液100ml∶40mg，廣東天之驕藥物開發有限公司實驗室提供；昆明種小鼠40隻，由第一軍醫大學實驗動物中心提供，雌雄各半，體重20～25g；豚鼠6隻，由第一軍醫大學實驗動物中心提供，體重150～200g，雌雄各半。
2實驗方法與結果2.1急性毒性實驗取小鼠30隻，分為2組，每組15隻，雌雄各半，分別尾靜脈注射大黃素注射液0.4mg/kg，等量生理鹽水，給藥1次，觀察7d內動物的毒性反應，未見任何中毒症狀及動物死亡。
2.2過敏性實驗豚鼠6隻，雌雄各半，間日腹腔注射0.4mg/ml大黃素注射液0.08mg/kg，共3次；然後分為2組，每組3隻，分別於第一次腹腔注射的第14天和第21天在豚鼠右後肢掌外側靜脈注射同濃度同劑量的大黃素注射液，注射速度約2.0ml/min，注射後觀察15min內動物情況，如出現豎毛、呼吸困難、噴嚏、乾嘔或咳嗽3次等現象中的兩種或以上者，或出現羅音、抽搐虛脫、死亡現象之一者，則認定為過敏實驗陽性。
兩組豚鼠分別在首次腹腔注射大黃素注射液的第14天和第21天再次注射同樣藥物後的15min內，各鼠均無豎毛、呼吸困難、噴嚏、乾嘔或咳嗽，或發生羅音、抽搐、虛脫、死亡等現象，說明大黃素注射液豚鼠過敏實驗陰性。
實驗四大黃素抗肝纖維化作用1實驗材料SD大鼠50隻，雄性，由第一軍醫大學實驗動物中心提供，體重220～250g；大黃素注射液100ml∶100mg，廣東天之驕藥物開發有限公司實驗室提供；透明質酸放射免疫試劑盒及層粘連蛋白放射免疫試劑盒，海軍上海醫學研究所。
2實驗方法大鼠50隻隨機分為5組空白組、模型組、大黃素治療組(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)。模型組用橄欖油將CCl4稀釋成40％的溶液，首次以5ml/kg皮下注射，以後以3ml/kg皮下注射，3天1次，共42天。治療組在模型組的基礎上，同時給予不同劑量的大黃素注射液，每日1次，連續im給藥42天。
以放射免疫法測定血清透明質酸和層粘連蛋白取肝組織標本以10％福馬林固定，石蠟包埋，4μm連續切片，行VG和HE染色。光鏡下觀察HE及VG染色肝組織切片，將纖維增生程度分為0～4級。0級無纖維化；1級纖維結締組織只局限於匯管區擴大，有向小葉發展傾向；2級纖維結締組織增生進入肝小葉2/3及有1級同樣的改變；3級纖維結締組織增生進入小葉達中央靜脈周圍；4級纖維結締組織在全小葉多處瀰漫性增生，假小葉形成，並有3級同樣的改變。
用2.5％戊二酮固定標本，經1％鋨酸固定2h，丙酮乙醇逐級脫水，環氧樹脂包埋，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，超薄切片，透射電鏡觀察。
3實驗結果3.1大黃素注射液對血清透明質酸及層粘連蛋白影響 與正常組比較，模型組血清透明質酸及層粘連蛋白顯著升高(P＜0.001)；與模型組比較，大黃素治療組血清透明質酸及層粘連蛋白降低，結果見表3。
表3大黃素注射液對血清透明質酸及層粘連蛋白影響(x±s，n＝10)透明質酸含量 層粘連蛋白含量組別(μg/l) (μg/l)正常組 63.1±20.9 24.6±6.4模型組 167.8±43.7Δ79.3±27.2Δ10mg/kg95.3±34.0*48.6±18.7*大黃素治療組 20mg/kg86.8±47.4*37.5±17.5*40mg/kg75.6±33.3**34.7±17.4**注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較，ΔP＜0.0013.2大黃素對肝組織病理學的影響正常組肝臟肝板以中央靜脈為中心呈條索狀向四周放射樣排列，板間有不規則肝竇，肝小葉內網狀纖維支架完整，分布規律，無膠原纖維存在。模型組肝細胞變性壞死，肝小葉結構破壞，纖維結締增生，假小葉形成。大黃素治療組肝細胞變性壞死明顯減輕，纖維結締明顯減少，未見明顯的假小葉形成。各組肝纖維化情況見表4，與模型組比較，大黃素能明顯改善肝纖維化程度。
表4大黃素對肝組織病理學的影響(只)纖維化分級組別 U0 IIIIIIIV正常組1000 0 0模型組0 02 3 510mg/kg 0 24 3 1 2.03*大黃素治療組 20mg/kg 0 53 2 0 2.87**40mg/kg 0 63 1 0 2.93**注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.014電鏡觀察正常肝細胞呈多面體，細胞核為圓形或橢圓形，核膜清晰，胞漿內有散布的核糖體，有分布規律的內質網，線粒體呈圓形或橢圓形。模型組肝細胞核固縮、變形，核膜模糊不清，線粒體腫脹、結構模糊、嵴減少，內質網溶解，胞漿內有大量脂滴，核糖體脫失。大黃素治療組肝細胞損害減輕，無明顯的脂滴，線粒體膜性結構可見，內質網存在，但不如正常組規律。
實驗五正交設計研製大黃素羥丙基-β-CD包合物1儀器與試藥日本島津LC-10AT高效液相色譜儀；日本島津SPD-6A紫外檢測器；大黃素對照品，中國生物製品檢定所；羥丙基-β-CD(HP-β-CD)，Aldrich Chem Co.。甲醇為色譜純，Fisher公司；其餘均為分析純，水為超純水。
2方法與結果2.1正交設計 經預實驗及總結文獻資料，影響製備大黃素HP-β-CD包合物的因素主要為A(HP-β-CD與大黃素摩爾比)、B(攪拌時間)和C(包合溫度)3個因素，每個因素分了3個水平，按L9(34)正交試驗表設計實驗方案。其正交試驗方案和結果見表5、表6。
表5因素水平表水因素平A HP-β-CD與大黃素摩爾比 B攪拌時間(h)C包合溫度(℃)1 1∶1 0.5 402 2∶1 1603 3∶1 280表6正交試驗結果試驗號 A B C 藥物包合率(％)1A1B1C150.762A1B2C263.383A1B3C382.264A2B1C277.785A2B2C392.496A2B3C179.647A3B1C370.308A3B2C162.919A3B3C267.72K165.47 66.2864.44K283.30 72.9369.63K366.98 76.5481.68R17.84 10.2617.25
2.2大黃素HP-β-CD包合物 精密稱取HP-β-CD適量溶於100ml注射用水中，於相應溫度恆溫。精密稱取一定量的大黃素，用適量乙醇溶解後，在轉速為120r·min-1攪拌下緩緩滴入HP-β-CD溶液中，並繼續攪拌至規定時間，放入冰箱中冷藏24h，濾過，用適量甲醇洗滌包合物沉澱，40℃乾燥4h，精密稱重，研磨，過5號篩，含量測定，計算藥物包合率，置於乾燥器中備用。
2.3包合物大黃素含量測定2.3.1色譜條件色譜柱BeckmanC18反相色譜柱(4.6×25cm，5μm)；流動相甲醇0.1％磷酸(90∶10)，流速1.0ml/min，檢測波長286nm；柱溫室溫；定量方法外標法。
2.3.2對照品溶液的製備精密稱取大黃素對照品適量，加無水乙醇-醋酸乙酯(2∶1)製成每1ml含大黃素0.01mg的溶液。
2.3.3供試品溶液的製備精密稱取大黃素HP-β-CD包合物供試品10mg，用0.1mol/l的鹽酸溶液在37℃水浴中水解24h，醋酸乙酯萃取3次，合併萃取液，蒸乾，殘渣加醋酸乙酯定容至10ml量瓶中，搖勻，即得。
2.3.4標準曲線的製作 精密吸取對照品溶液4，8，10，15，20μl，分別注入高效液相色譜儀，以峰面積值為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，作線性回歸，得回歸方程Y＝98.813X-10.807，r＝0.9998，結果表明，大黃素在0.046～0.230μg範圍內呈良好的線性關係。
2.3.5精密度試驗 精密吸取供試液連續進樣測定5次，大黃素峰的RSD為1.2％。
2.3.6回收率實驗 精密稱取包合物適量，加入一定量的大黃素對照品水解於100ml量瓶中，按相同的方法處理並測定，大黃素的平均回收率為100.2％，RSD為1.3％。
2.4包合物的藥物包合率測定 藥物包合率是考察藥物被包合程度的指標之一。藥物包合率(％)＝包合物中藥物的量(g)/藥物投料總量(g)×100％2.5數據處理與結果分析 將表2的藥物包合率進行直觀分析和方差分析，結果見表7，並用綜合平衡法分析得到最佳條件為A2B3C3，即A2＝HP-β-CD大黃素(摩爾比)為2∶1；B3＝2h；C3＝80℃。各因素對藥物包合率影響大小順序為A＞C＞B。按此優化條件獲得5批大黃素HP-β-CD包合物的藥物包合率見表8。
表7方差分析表變異來源 SS γ MS F P總 1246.1128A586.758 2 293.37921.786 ＜0.05B162.667 2 81.334 6.040 ＜0.2C469.754 2 234.47717.442 ＜0.1誤差 26.933 2 13.466表8包合物的藥物包合率(n＝3，x±s)批號 藥物包合率(％)030924 90.2±3.4030925 90.5±0.4030926 87.1±2.7030927 86.9±2.7030928 86.4±2.5將上述5個批號的包合物的藥物包合率進行方差及q檢驗，結果表明5個批號間的藥物包合率差異無顯著性(P＞0.05)。兩兩批號間差異也無顯著性(P＞0.05)，說明處方設計合理，生產工藝穩定。
具體實施例方式
實施例一取羥丙基β-CD60g，加注射用水250ml，置50℃水浴中，攪拌使溶解；取大黃素2g，加70％乙醇50ml，攪拌使溶解，在40～80℃水浴保溫並攪拌狀態下，將大黃素乙醇溶液緩慢加入羥丙基β-CD溶液中，恆溫攪拌1h，加入氯化鈉45g，攪拌溶解，再加注射用水至5000ml，過濾，分裝成每瓶100ml，115℃滅菌30分鐘，包裝，即得。
實施例二取羥丙基β-CD120g，加注射用水2500ml，置70℃水浴中，攪拌使溶解；取大黃素8g，加80％乙醇100ml，攪拌使溶解，在40～80℃水浴保溫並攪拌狀態下，將大黃素乙醇溶液緩慢加入羥丙基β-CD溶液中，恆溫攪拌1.5h，加入氯化鈉90g，攪拌溶解，再加注射用水至10000ml，過濾，分裝成每瓶50ml，115℃滅菌30分鐘，包裝，即得。
實施例三(凍乾粉針劑)取羥丙基β-CD200g，加注射用水1000ml，置80℃水浴中，攪拌使溶解；取大黃素10g，加85％乙醇100ml，攪拌使溶解，在40～80℃水浴保溫並攪拌狀態下，將大黃素乙醇溶液緩慢加入羥丙基β-CD溶液中，恆溫攪拌2h，加入甘露醇100g，攪拌溶解，再加注射用水至1500ml，無菌過濾，西林瓶分裝成每瓶6ml，冷凍乾燥，包裝，即得。
實施例四(凍乾粉針劑)取羥丙基β-CD150g，加注射用水500ml，置60℃水浴中，攪拌使溶解；取大黃素8g，加90％乙醇50ml，攪拌使溶解，在40～80℃水浴保溫並攪拌狀態下，將大黃素乙醇溶液緩慢加入羥丙基β-CD溶液中，恆溫攪拌5h，加入甘露醇100g，攪拌溶解，再加注射用水至1000ml，無菌過濾，西林瓶分裝成每瓶5ml，冷凍乾燥，包裝，即得。
權利要求
1一種大黃素輸液劑，其特徵在於它是由大黃素與複合劑形成的複合體和注射劑用水溶性藥用輔料組成的。
2一種大黃素凍乾粉針劑，其特徵在於它是由大黃素與複合劑形成的複合體以及注射劑用水溶性藥用輔料和凍幹賦形劑組成的。
3根據權利要求1或2所述的輸液劑或凍乾粉針劑中大黃素與複合劑形成的複合體，大黃素與複合劑的摩爾比為1∶1～1∶10。
4根據權利要求1或2所述的輸液劑或凍乾粉針劑中大黃素與複合劑形成的複合體，大黃素與複合劑的最佳摩爾比為1∶2
5根據權利要求1或2所述的輸液劑或凍乾粉針劑，其中的複合劑為易溶於水的帶有多羥基的大分子物質，包括改性澱粉、糊精、環糊精、β-CD。
6根據權利要求1或2所述的輸液劑或凍乾粉針劑，其中的複合劑也可以是羥丙基β-CD。
7根據權利要求1或2所述的輸液劑或凍乾粉針劑，其中的注射劑用水溶性藥用輔料為氯化鈉、葡萄糖中的一種。
8根據權利要求2所述的凍乾粉針劑，其中的凍幹賦形劑也可以是甘露醇、乳糖、蔗糖、或葡萄糖中的一種或兩種的複合賦形劑。
9一種大黃素輸液劑的製備方法，其特徵在於大黃素用70～95％的乙醇溶解後，在40～80℃水浴保溫並攪拌狀態下，將大黃素乙醇溶液緩慢加入複合劑溶液中，恆溫攪拌0.5～2h，得大黃素與複合劑的複合體溶液，向大黃素與複合劑的複合體溶液中加入適量注射劑用水溶性藥用輔料，攪拌使溶解，再補充適量注射用水，攪勻，過濾、分裝、滅菌、包裝即得本發明的大黃素注射製劑的輸液劑。
10一種大黃素凍乾粉針劑的製備方法，其特徵在於大黃素用70～95％的乙醇溶解後，在40～80℃水浴保溫並攪拌狀態下，將大黃素乙醇溶液緩慢加入複合劑溶液中，恆溫攪拌0.5～2h，得大黃素與複合劑的複合體溶液，向大黃素與複合劑的複合體溶液中加入適量注射劑用水溶性藥用輔料，攪拌使溶解，加入凍幹賦形劑，經過濾、分裝，冷凍乾燥，即得本發明的大黃素注射製劑的凍乾粉針劑。
全文摘要
本發明涉及一種大黃素注射製劑，其特徵在於它是通過將大黃素與複合劑複合，形成了大黃素與複合劑的複合體，增加了大黃素在水中的溶解度及製劑的穩定性，在此基礎上製備成大黃素注射製劑，特別是製成靜脈注射劑，包括大、小容量的輸液劑和凍乾粉針劑，可用於治療癌症、肝病、腎病等。
文檔編號A61K31/122GK1555785SQ20041000231
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月8日 優先權日2004年1月8日
發明者張正生 申請人:張正生