一種抗嗜水氣單胞菌感染的微膠囊疫苗製備方法

2023-07-12 06:18:51 3

專利名稱：一種抗嗜水氣單胞菌感染的微膠囊疫苗製備方法
技術領域：
本發明涉及一種防治魚類細菌性敗血症疫苗的製備方法，更具體地，涉及一種用 於防治由嗜水氣單胞菌引起的西伯利亞鱘細菌性敗血症的微膠襄疫苗的製備方法。
背景技術：
由嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的魚類細菌性敗血症，每年都會給 魚類養殖帶來巨大的經濟損失。目前研究表明，注射適量的嗜水氣單胞菌滅活疫苗能夠顯 著增強魚類的非特異免疫活性和抗感染能力，但以疫苗注射為手段的免疫療法在養殖實踐 操作中費時費力，不利於大規模推廣。西伯利亞鱘隸屬於鱘科、鱘屬，是現存沈種鱘魚中的一種，主要分布在俄羅斯西 部的鄂畢河至東部的科雷馬河之間的西伯利亞各河流之中。我國自1992年開始人工養殖 以來，至今已經形成了龐大的養殖規模，養殖產量高達幾千噸。然而，我國西伯利亞鱘養殖 一直深受病害的困擾，尤其是由嗜水氣單胞菌引起的細菌性敗血症，每年都會給西伯利亞 鱘養殖帶來巨大的經濟損失。目前研究表明，注射適量的嗜水氣單胞菌滅活疫苗能夠顯著 增強西伯利亞鱘的非特異免疫活性和抗感染能力，但以疫苗注射為手段的免疫療法在養殖 實踐操作中費時費力，不利於大規模推廣。近年來，微膠囊技術在人和畜禽口服疫苗研究中 的應用日益廣泛，有關水產動物微膠囊口服疫苗的研究也取得一定進展。但還沒有針對鱘 魚細菌性敗血症防治的膠囊疫苗製備。

發明內容
為了克服疫苗注射為手段的免疫療法在魚類養殖實踐操作中費時費力，不利於大 規模推廣的問題，發明人提供了一種用於西伯利亞鱘細菌性敗血症防治的微膠囊疫苗的制 備方法。可用於製備防治鱘魚，尤其是西伯利亞鱘細菌性敗血症的微膠囊疫苗。實現本發明的技術方案如下
提供一種抗嗜水氣單胞菌感染的微膠囊疫苗製備方法，包括以下步驟
1)嗜水氣單胞菌菌懸液的製備
將嗜水氣單胞菌接種於PH7. 2的普通營養肉湯中，於30°C，150轉/min搖床振蕩培養 24-72 h後離心洗滌，製成有效活菌含量為101°個/ml的菌懸液，並用福馬林滅活，保存；
2)嗜水氣單胞菌微膠囊疫苗的製備
將上述步驟製備的菌懸液與5%海藻酸鈉溶液以1: 1的比例，在漩渦振蕩器上混合均 勻，進行噴霧乾燥處理，得微膠囊顆粒。所述的步驟1)嗜水氣單胞菌菌懸液的製備中，優選條件為將嗜水氣單胞菌接種 於PH7.2的普通營養肉湯中，於30°C，150轉/min搖床振蕩培養48 h後離心洗滌，製成有 效活菌含量為101°個/ml的菌懸液，並用福馬林滅活，保存。所述的離心為於3000轉/min離心20 min,所述的洗滌為用無菌生理鹽水洗滌3 次，所述的保存為於4°C冰箱保存。
所述的步驟2)中嗜水氣單胞菌微膠囊疫苗的製備中，將上述步驟製備的菌懸液與 5%海藻酸鈉溶液以1:1的比例，在漩渦振蕩器上混合均勻，得到物料溶液，將其進行噴霧幹 燥處理，得微膠囊顆粒。所述的噴霧乾燥參數為風量100%，進風溫度100 0C -120 °C，出風溫度 450C -55°C，進料量30-40ml/h，通針頻率5 s ；噴霧乾燥期間保持氣流量為550-650 m3/h ； 氣體通過鼓風機後被過濾並加熱到設置溫度110-120°C，
所述的噴霧乾燥參數優選為風量100%，進風溫度115°C，出風溫度48°C，進料量35 ml/h，通針頻率5 s;噴霧乾燥期間保持氣流量為600 m3/h ；氣體通過鼓風機後被過濾並加 熱到設置溫度115°C。所述的物料溶液進行噴霧乾燥處理後，由蠕動泵將物料溶液傳送到噴霧器，通過 旋風分離器收集微囊顆粒。針對日益嚴重的細菌性疾病，越來越多的水產養殖研究者傾向採用疫苗接種法 進行防治。與其它免疫接種方法相比，口服免疫法更適合於大規模的養殖魚群，不受魚的大 小及時間的限制，對魚也不產生應激反應，尤其易於多次重複免疫，因而解決了魚類再次免 疫的技術難題。本發明以西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌的微膠囊疫苗為研究對 象，觀察了其對西伯利亞鱘非特異性免疫和抗感染能力的效果，提供了一種專用於鱘魚細 菌性敗血症防治的微膠囊疫苗製備方法，並通過所提供的測定方法驗證了該製備方法所得 產品的有效性。


圖1 BABL/C小白鼠抗血清抗體凝集效價測定；
圖2西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗對西伯利亞鱘 過氧化酶含量的影響；
圖3西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗對西伯利亞鱘 血清鹼性磷酸酶含量的影響；
圖4西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗對西伯利亞鱘 血清溶
菌酶含量的影響。
具體實施例方式應當理解，下面實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員 常規採用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實驗指南》第三版，或按照製造廠 商所建議的步驟和條件。實施例中，所涉及的部分材料來源如下
西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Si，購於農業部漁業動植物病原 庫；普通營養肉湯、無菌生理鹽水、福馬林、海藻酸鈉，購於國藥集團(上海)化學試劑有限 公司；溫控搖床，購於美國Thermo i^orma公司；高速離心機，購於日本三洋公司；漩渦振蕩 儀，購於上海淇特分析儀器有限公司；小型噴霧乾燥儀SY-6000，購於上海世遠生物設備工程有效公司；西伯利亞鱘，健康無病傷，體重50 70克，體長13 16釐米，均購於浙江省千 島湖鱘魚養殖基地；BABL/C小白鼠，購於上海第二軍醫大學；過氧化酶檢測試劑盒、溶菌酶 檢測試劑盒、蛋白定量(雙縮脲法)測試盒，購於南京建成生物工程研究所第一分所；PH7. 2 的普通營養肉湯、5%海藻酸鈉溶液在1 X IO51 高壓溼熱滅菌20 min後備用。實施例一
嗜水氣單胞菌菌懸液的製備
在無菌條件下將試管斜面培養基上保存的西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單 胞菌菌株Sl接種於PH7.2的普通營養肉湯中，於30°C，150轉/min搖床振蕩培養48 h後 於3000轉/min離心20 min,用無菌生理鹽水洗滌3次，製成有效活菌含量為101°個/ml的 西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl菌懸液，並用福馬林滅活，於4°C 冰箱保存。實施例二
嗜水氣單胞菌微膠囊疫苗的製備
將4°C冰箱保藏滅活的西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl菌懸液 200 ml與5%海藻酸鈉溶液200 ml在漩渦振蕩器上混合均勻，打開鼓風機，緊接著打開噴霧 乾燥儀、蠕動泵和通針泵，設置參數為風量顯示100%，進風溫度115°C，出風溫度48°C，進 料量35 ml/h，通針頻率5 S。噴霧乾燥期間保持氣流量為600 m3/h。氣體通過鼓風機後被 過濾並加熱到設置溫度115°C，蠕動泵將物料溶液傳送到噴霧器，通過旋風分離器收集微囊 顆粒，於4°C冰箱中保存。實施例三
嗜水氣單胞菌微膠囊疫苗免疫原性的測定
1、隨機選取健康4周齡雌性的BABL/C小白鼠30隻，隨機分成2組，即西伯利亞鱘細菌 性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗拌飼口服組、對照組，每組各設3個平行。 其中，西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗拌飼口服組BABL/ C小白鼠每天投餵含有西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗 的飼料，西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗的添加劑量為6 g/Kg飼料，對照組BABL/C小白鼠每天投餵不含西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單 胞菌菌株Sl微膠囊疫苗的添加劑量為6 g/Kg飼料，連續投餵7天，之後停飼並分別立即將 各組BABL/C小白鼠進行眼眶取血並收集於離心管中，室溫靜置2 h後4°C過夜，然後於4°C、 5000轉/min條件下離心15 min後取上清，採用間接酶聯免疫吸附法進行抗體凝集效價測 定，以西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗拌飼口服組BABL/ C小白鼠陽性稀釋血清在405納米波長處的吸光度值與對照組BABL/C小白鼠陰性血清在 405納米波長處的吸光度值的比值大於2. 1時的陽性血清抗體最大稀釋倍數為抗體效價。2、嗜水氣單胞菌微膠囊疫苗的血清抗體凝集效價
西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Si微膠囊疫苗的血清抗體凝集效 價測定結果見圖1.實驗結果表明，採用間接酶聯免疫吸附法測得西伯利亞鱘細菌性敗血 症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗拌飼口服組的BABL/C小白鼠抗血清抗體凝集效 價為6400。實施例四嗜水氣單胞菌微膠囊疫苗對西伯利亞鱘非特異免疫效果的測定
1、隨機選取健康西伯利亞鱘600尾，隨機分成2組，即西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性 嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗拌飼口服組、對照組，每組各設3個平行。其中，西伯利亞 鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗拌飼口服組的西伯利亞鱘每天投 餵含有西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗的飼料，西伯利 亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗的添加劑量為6 g/Kg飼料，連 續投餵7天，之後改投不含西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫 苗的飼料；對照組西伯利亞鱘一直投餵不含西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌 菌株Sl微膠囊疫苗的飼料，每天投飼量均為西伯利亞鱘總體重的3%。在停飼含西伯利亞鱘 細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗的飼料後每隔7天分別在各個組中 取西伯利亞鱘採血製備血清，按照檢測試劑盒說明書測定血清過氧化酶、免疫球蛋白、溶菌 酶的含量。試驗周期為35天，試驗期間連續充氧，水溫控制在20 21°C。2、試驗結果
2.1西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗對西伯利亞鱘 血清過氧化酶含量的影響
西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗對西伯利亞鱘血清 過氧化酶含量的影響的結果見圖2。實驗結果表明，西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水 氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗能夠顯著提高西伯利亞鱘的血清過氧化物酶含量。具體表現 在在連續口服西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗7天後的 觀天內，西伯利亞鱘血清過氧化物酶含量較對照組有顯著升高，其中西伯利亞鱘血清過氧 化物酶含量在連續口服西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗 7天後的第21天達到最大值，為6. 86 U/mgprot，較對照組提高了 50. 15%。2. 2西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗對西伯利 亞鱘血清免疫球蛋白含量的影響
西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Si微膠囊疫苗對西伯利亞鱘血清 免疫球蛋白含量的影響的結果見圖3。實驗結果表明，西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜 水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗能夠顯著提高西伯利亞鱘的血清鹼性磷酸酶含量。具體表 現在在連續口服西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗7天後 的觀天內，西伯利亞鱘血清鹼性磷酸酶含量較對照組有顯著升高，尤其是西伯利亞鱘血清 鹼性磷酸酶含量在連續口服西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊 疫苗7天後的第21天達到最大值，為67. 37 U/L，較對照組提高了 52. 91%。2. 3西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗對西伯利 亞鱘血清溶菌酶含量的影響
西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Si微膠囊疫苗對西伯利亞鱘血清 溶菌酶含量的影響的結果見圖4。實驗結果表明，西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單 胞菌菌株Sl微膠囊疫苗能夠顯著提高西伯利亞鱘的血清溶菌酶含量。具體表現在在連續 口服西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗7天後的觀天內， 西伯利亞鱘血清溶菌酶含量較對照組有顯著升高，尤其是西伯利亞鱘血清溶菌酶含量在連 續口服西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗7天後的第21天達到最大值，為191. 43 U/ml，較對照組提高了 92. 51%。實施例五
嗜水氣單胞菌微膠囊疫苗對西伯利亞鱘相對免疫保護率的測定 1、隨機選取健康西伯利亞鱘20尾，隨機分成2組，即西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性 嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗拌飼口服組、對照組。其中，西伯利亞鱘細菌性敗血症致 病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗拌飼口服組的西伯利亞鱘每天投餵含有西伯利亞鱘 細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗的飼料，西伯利亞鱘細菌性敗血症 致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗的添加劑量為6 g/Kg飼料，連續投餵7天，之後改 投不含西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗的飼料；對照組 西伯利亞鱘一直投餵不含西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫 苗的飼料，每天投飼量均為西伯利亞鱘總體重的3%。在停飼含西伯利亞鱘細菌性敗血症致 病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗的的飼料後21天用有效活菌含量為1. 0 X IO7個/ml 西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl菌懸液進行胸鰭基部注射感染，每 尾注射劑量為0. 2 ml，對照組注射等量的無菌生理鹽水。連續觀察7天，記錄對照組西伯利 亞鱘的死亡數目和西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗拌飼 口服組西伯利亞鱘的死亡數目，計算相對免疫保護率。2、西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗對西伯利亞 鱘相對免疫保護率的測定
西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株Si微膠囊疫苗對西伯利亞鱘相對 免疫保護率的測定結果見表1。實驗結果表明，西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞 菌菌株Sl微膠囊疫苗對西伯利亞鱘抗西伯利亞鱘細菌性敗血症致病性嗜水氣單胞菌菌株 Sl感染具有良好的免疫保護效果，其對西伯利亞鱘的免疫保護率為50%。表1嗜水氣單胞菌菌株Sl微膠囊疫苗對西伯利亞鱘的免疫保護率
權利要求
1.一種抗嗜水氣單胞菌感染的微膠囊疫苗製備方法，包括以下步驟1)嗜水氣單胞菌菌懸液的製備將嗜水氣單胞菌接種於PH7. 2的普通營養肉湯中，於30°C，150轉/min搖床振蕩培養 24-72 h後離心洗滌，製成有效活菌含量為101°個/ml的菌懸液，並用福馬林滅活，保存；2)嗜水氣單胞菌微膠囊疫苗的製備將上述步驟製備的菌懸液與5%海藻酸鈉溶液以1: 1的比例，在漩渦振蕩器上混合均 勻，得到物料溶液，進行噴霧乾燥處理，得微膠囊顆粒。
2.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述的步驟1)嗜水氣單胞菌菌懸液的 製備中，將嗜水氣單胞菌接種於PH7. 2的普通營養肉湯中，於30°C，150轉/min搖床振蕩培 養48 h後離心洗滌。
3.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟1)中所述的離心為於3000轉/ min離心20 min，所述的洗滌為用無菌生理鹽水洗滌3次，所述的保存為於4°C冰箱保存。
4.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)中所述的噴霧乾燥參數為風 量100%，進風溫度100°C -120°C，出風溫度45°C _55°C，進料量30_40ml/h，通針頻率5 s ； 噴霧乾燥期間保持氣流量為550-650 m3/h ；氣體通過鼓風機後被過濾並加熱到設置溫度 110-120°C。
5.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述的噴霧乾燥參數為風量100%，進 風溫度115°C，出風溫度48°C，進料量35 ml/h，通針頻率5 s ；噴霧乾燥期間保持氣流量為 600 m3/h ；氣體通過鼓風機後被過濾並加熱到設置溫度115°C。
6.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)中所述的物料溶液進行噴霧幹 燥處理後，由蠕動泵將物料溶液傳送到噴霧器，通過旋風分離器收集微囊顆粒。
全文摘要
本發明公開了一種抗嗜水氣單胞菌感染的微膠囊疫苗製備方法。涉及抗細菌性疫苗製備領域。克服了疫苗注射為手段的免疫療法在魚類養殖實踐操作中費時費力，不利於大規模推廣的問題。本發明提供的抗嗜水氣單胞菌感染的微膠囊疫苗製備方法,包括以下步驟1)嗜水氣單胞菌菌懸液的製備將嗜水氣單胞菌接種後製成有效活菌含量為1010個/ml的菌懸液，並用福馬林滅活，保存；2)嗜水氣單胞菌微膠囊疫苗的製備，將上述步驟製備的菌懸液與5%海藻酸鈉溶液以1:1的比例，在漩渦振蕩器上混合均勻，進行噴霧乾燥處理，得微膠囊顆粒。該方法可用於製備防治鱘魚，尤其是西伯利亞鱘細菌性敗血症的微膠囊疫苗。
文檔編號A61K9/50GK102139102SQ201110082219
公開日2011年8月3日 申請日期2011年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者何珊, 劉麗玲, 衛若鵬, 呂利群, 曹海鵬, 楊先樂 申請人:上海海洋大學