一種樹突狀細胞疫苗製備方法
2023-08-08 18:08:31 3
專利名稱：一種樹突狀細胞疫苗製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說是一種樹突狀細胞疫苗製備方法。
背景技術：
DC名為樹突狀細胞，它是機體重要的免疫細胞，在細胞免疫治療上有著廣泛的應用前景，在特異的腫瘤抗原刺激下，成熟的樹突狀細胞能表達多種細胞因子和趨化因子，如，MHC II分子HLA-DR，共刺激分子⑶80，⑶86等多種細胞因子，有效誘導抗原特異性和非特異性免疫應答反應，增強機體免疫功能。但DC在人外周血中比例很低，因此提高擴增倍數，增加成熟的樹突狀細胞數，對治療效果起著關鍵的作用。
現在樹突狀細胞做的很熱，常規技術是用GM-CSF+IL4，這種方法的擴增倍數不高，成熟度不高，一般成熟的樹突狀細胞數只能達到2X 106，成熟的樹突狀細胞純度在60%，參見圖I。也有採用加入Flt3來進行擴增的，但其中還會加入化學藥物，而且擴增倍數及成熟度也並不高。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種用於腫瘤治療用的樹突狀細胞治療性疫苗的製備方法，有效提高樹突狀細胞擴增，使人PBMC中未成熟的樹突狀細胞在體外培養條件下擴增倍數提高，提高成熟度，且不添加化學藥物，純淨度高。為實現上述目的，設計一種樹突狀細胞疫苗製備方法，其特徵在於採用如下製備步驟(1)取17ml病患自體血，採用人淋巴細胞分離液分離出紅細胞、單核淋巴細胞、血漿；
(2)用GT-T551無血清培養基調整單核淋巴細胞濃度為2X IO6個/ml ; (3)將調整好濃度的單核淋巴細胞以3ml/孔加入6孔板中，貼壁16小時；(4)吸棄6孔板的每個孔內的上層未貼壁細胞，在每個孔的下層即留下未成熟DC細胞；(5)再在6孔板的每個孔內分別加入DC培養基3ml，置於二氧化碳培養箱內，二氧化碳濃度為5 %，溫度為37°C，培養2 3天；(6 )吸棄6孔板的每個孔內DC培養基一半I. 5ml，每個孔內再補充DC培養基I. 5ml，進行半量換液；(7)以第一次加入DC培養基開始計算的第6天，荷載自體腫瘤抗原，使6孔板的每個孔內的自體腫瘤抗原的濃度為20 μ g/ml ； (8)24小時後檢測成熟DC細胞的數量和成熟度；所述的DC培養基由上述步驟(I)中分離出的自體血漿、GM-CSF、IL-4、Flt3、及GT-T551無血清培養基所組成，其中自體血漿佔整個DC培養基體積的I %，GM-CSF佔整個DC培養基的濃度為50ng/ml，IL-4佔整個DC培養基的濃度為100ng/ml，Flt3佔整個DC培養基的濃度為100ng/ml，GT-T551無血清培養基佔整個DC培養基體積的96%。本發明同現有技術相比，分離出的自體血漿再利用，用人血漿替換為離體的人AB血清；在該DC培養基中加入Flt3，可以增強刺激樹突狀細胞擴增倍數，成熟的樹突狀細胞數至少達到IX 107，成熟樹突狀細胞的成熟度> 85% ;解決了樹突狀細胞製備過程中細胞數量少，增殖慢的問題；用自身特異的腫瘤幹細胞裂解液，作為腫瘤抗原，細胞的特異性殺傷力更強；且原料不添加額外的化學藥物，純淨度高。
圖I為原有的方法製備出的成熟的樹突狀細胞的純度圖。圖2為採用本發明製備出的成熟的樹突狀細胞的純度圖。
具體實施例方式下面結合實例對本發明作進一步地說明。(I)取18ml病患自體血，取其中Iml病患自體血做流式細胞檢測，用於治療前免疫指標的評價，另外17ml病患自體血採用人淋巴細胞分離液分離出紅細胞、單核淋巴細胞、 血漿；
(2)用GT-T551無血清培養基調整單核淋巴細胞濃度為2XIO6個/ml ；
(3)將調整好濃度的單核淋巴細胞以3ml/孔加入6孔板中，貼壁16小時；
(4)在6孔板的每個孔內吸棄上層非貼壁細胞，在每個孔內即留下下層貼壁的未成熟的DC細胞；
(5)再在6孔板的每個孔內分別加入DC培養基3ml,置於二氧化碳培養箱內，其中CO2濃度為5%，溫度為37°C，培養2 3天；
(6)吸棄6孔板的每個孔內的DC培養基I.5ml，再另取I. 5ml的DC培養基放在每個孔
內；
(7)以第一次加入DC培養基開始計算的第6天，荷載病患自體腫瘤抗原，使DC細胞成熟並製備成自體腫瘤抗原特異性DC疫苗，其中6孔板的每個孔內的自體腫瘤抗原的濃度為20 μ g/ml ；
(8)24小時後檢測成熟DC細胞的數量和成熟度。所述的DC培養基由上述步驟(I)中分離出的自體血漿、GM-CSF, IL_4、Flt3、GT-T551無血清培養基所組成，其中自體血漿佔整個DC培養基的體積為1%，GM-CSF佔整個DC培養基的濃度為50ng/ml，IL-4佔整個DC培養基的濃度為100ng/ml，Flt3佔整個DC培養基的濃度為100ng/ml，GT-T551無血清培養基佔整個DC培養基的體積為96%。相對於原有技術取血量多，擴增倍數少的情況，本發明提供的這種新的腫瘤樹突狀細胞治療性疫苗的製備方法，用於腫瘤的預防及治療，具有取血量少、製備簡便、細胞增殖數量多、療效好、特異性殺傷力強的特點，其中成熟的樹突狀細胞數至少達到1X107，成熟樹突狀細胞的成熟度> 85%，參見圖2。
權利要求
1.一種樹突狀細胞疫苗製備方法，其特徵在於採用如下製備步驟(I)取17ml病患自體血，採用人淋巴細胞分離液分離出紅細胞、單核淋巴細胞、血漿；(2)用GT-T551無血清培養基調整單核淋巴細胞濃度為2X IO6個/ml ; (3)將調整好濃度的單核淋巴細胞以3ml/孔加入6孔板中，貼壁16小時 ；(4)吸棄6孔板的每個孔內的上層未貼壁細胞，在每個孔的下層即留下未成熟DC細胞；(5)再在6孔板的每個孔內分別加入DC培養基3ml，置於ニ氧化碳培養箱內，ニ氧化碳濃度為5%，溫度為37 °C，培養2 3天；(6)吸棄6孔板的每個孔內DC培養基一半I. 5ml，每個孔內再補充DC培養基I. 5ml，進行半量換液；(7)以第一次加入DC培養基開始計算的第6天，荷載自體腫瘤抗原，使6孔板的每個孔內的自體腫瘤抗原的濃度為20 μ g/ml ; (8) 24小時後檢測成熟DC細胞的數量和成熟度；所述的DC培養基由上述步驟(I)中分離出的自體血漿、GM-CSF、IL-4、Flt3、及GT-T551無血清培養基所組成，其中自體血漿佔整個DC培養基體積的I %，GM-CSF佔整個DC培養基的濃度為50ng/ml，IL-4佔整個DC培養基的濃度為100ng/ml，Flt3佔整個DC培養基的濃度為100ng/ml，GT-T551無血清培養基佔整個DC培養基體積的96%。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體地說是一種樹突狀細胞疫苗製備方法，其特徵在於採用如下製備步驟(1)取病患自體血，採用人淋巴細胞分離液分離出紅細胞、單核淋巴細胞、血漿；(2)調整單核淋巴細胞濃度；(3)加入6孔板中，貼壁16小時；(4)吸棄6孔板的每個孔內的上層未貼壁細胞；(5)加入DC培養基3ml，置於二氧化碳培養箱內，二氧化碳濃度為5％，溫度為37℃，培養2～3天；(6)進行半量換液；(7)第6天，荷載自體腫瘤抗原，使6孔板的每個孔內的自體腫瘤抗原的濃度為20μg/ml；(8)24小時後檢測成熟DC細胞的數量和成熟度。本發明同現有技術相比，成熟的樹突狀細胞數至少達到1×107，成熟度＞85%。
文檔編號C12N5/0784GK102847145SQ20121037007
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者儲以微, 鄭秀娟, 張丹 申請人:復旦大學