抗β-catenin單克隆抗體製備及在結腸癌病理檢測中的應用的製作方法

2023-07-17 00:34:51

專利名稱：抗β-catenin單克隆抗體製備及在結腸癌病理檢測中的應用的製作方法
抗(3-catenin單克隆抗體製備及在結腸癌病理檢測中的應用技術領域抗(3-catenin單克隆抗體製備及在結腸癌病理檢測中的應用，屬於生物醫 藥技術領域。
技術背景P-catenin是一種新的原癌基因產物，也是細胞內十分重要的信號分子， 它在腫瘤病因研究領域中有重要作用。(3-catenin的相對分子質量約為92000， 其編碼基因定位於人類染色體3p21。它的功能參與鈣黏蛋白介導的細胞間黏 附，並且作為Wnt信號通路的重要成員參與細胞增殖、分化的調節，是近年 來大腸癌研究領域的熱點。然而，用於臨床的P-catenin抗體國內生產很少， 為了能夠提供質優、價廉的P-catenin抗體，我們應用美國MD公司製備的小鼠 重組(3-catenin蛋白製備了抗p-catenin單克隆抗體，並分析了 P-catenin蛋白在人 結腸癌細胞株以及在結腸良、惡性腫瘤組織中的表達情況。從實驗結果來看， 本發明製備的抗體具有效價高，特異性強等特點，可用於科研或臨床診斷結腸癌o發明內容本發明的目的是提供抗P-catenin單克隆抗體製備及在結腸癌病理檢測中 的應用，為P-catenin蛋白的表達、腫瘤病因研究提供有價值的物質條件。本發明的技術方案 一種抗P-catenin單克隆抗體的製備方法，應用重組 小鼠|3—catenin蛋白，免疫Balb/c小鼠，應用雜交瘤技術，通過ELISA雙篩得 至Ul株抗(3-catenin單抗lD3，其亞型為IgG2a;步驟為將免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，HAT培養液選擇培養IO天， 6塊96孔板中500孔有雜交瘤細胞生長，融合率為卯％;融合後第12天，進行 第1次ELISA雙篩選，先將吸出的上清分別與融合蛋白P-catenin和P21包被的 抗原板行EL1SA檢測，選擇P-catenin為陽性而P21為陰性的克隆進行第一次亞 克隆，此後重複進行ELISA篩選及亞克隆3-4次，最後獲得l株能穩定分泌抗 P-cateninMcAb的雜交瘤細胞株，命名1D3，亞類鑑定為IgG2a。抗(3-catenin單克隆抗體在結腸癌病理檢測中的應用用免疫印跡法Western blot檢測(3-catenin抗體的純度和特異性以及結腸癌 細胞系SW48和HCT116中卩-catenin蛋白的表達；用免疫組化SP法檢測 p-catenin在正常結腸組織和結腸癌組織中的不同表達；結果顯示3(1) 抗(3-catenin抗體特異結合(3-catenin重組蛋白P-catenin重組蛋白經8 %的SDS-PAGE電泳，將凝膠中的(3-catenin轉移至 PVDF膜上，封閉後，用抗(3-catenin抗體進行免疫染色，加入製備並純化的 P-catenin抗體，工作濃度l : 2 000， 4。C過夜，加入HRP標記的羊抗鼠抗體， 工作濃度l : 5000，於37'C反應lh，出現Mr為92 000的條帶，與文獻報導相符， 證明此抗體為抗(3-catenin的特異性抗體；(2) 抗(3-catenin抗體在結腸癌細胞株中的應用 從人結腸癌細胞株SW48和HCT116中分別提取細胞總蛋白，用製備的抗p-catenin抗體做免疫印跡檢測，得到兩條特異性條帶，說明這兩種結腸癌 細胞株均為P-catenin蛋白表達；(3 ) P-catenin在結腸癌組織中的表達應用抗P-catenin抗體對正常結腸和結腸癌(3-catenin的表達進行定位分 析，按常規法作病理切片進行免疫組化染色， 一抗為兔抗卩-catenin，稀釋度 為l : 100，並用PBS替代一抗作為空白對照，DAB顯色，蘇木精復染，結果 顯示，(3-catenin在正常結腸組織中表達在細胞膜上，而在結腸癌組織中有 52.17 %為陽性表達，並且發現P-catenin在細胞漿中大量表達，提示結腸癌發 生後p-catenin由細胞膜易位入細胞漿。本發明的有益效果本發明應用重組小鼠P—catenin蛋白，免疫Balb/c小 鼠，應用雜交瘤技術，通過ELISA雙篩得至Ul株抗(3-catenin單抗lD3，其亞型 為lgG2a。用免疫印跡法(Western blot)檢測P-catenin抗體的純度和特異性以及 結腸癌細胞系SW48和HCT116中卩-catenin蛋白的表達。用免疫組化SP法檢測 P-catenin在正常結腸組織和結腸癌組織中的不同表達。結果，將P-catenin經 SDS—PAGE分離，可見1條相對分子質量為92000的蛋白條帶,與文獻報導相 符。用抗P-catenin單克隆抗體做Westem blot分析顯示，在分子量92000處有1 條明顯的區帶，證明是抗(3-catenin特異性抗體。從人結腸癌細胞株SW48和 HCT116提取全細胞蛋白，經用所製備的p-catenin抗體反應，均可觀察到 (3-catenin蛋白的表達。人結腸組織切片經抗P-eatenin抗體免疫組化染色，在 正常結腸組織細胞膜中可見棕黃色顆粒，而在結腸癌組織的細胞漿中可見棕 黃色顆粒。本發明製備了高效價、特異性的抗p-catenin單克隆抗體。用該抗 體檢測證實，正常結腸組織P-catenin表達在細胞膜中，而結腸癌組織(3-catenin 則在細胞漿中表達。提示結腸癌發生後P-catenin由細胞膜易位入細胞漿中表 達，這可作為結腸癌的診斷的參考指標。


圖l抗P-catenin抗體特異性的Western blotting分析。1、 P21蛋白，2、 P-catenin重組蛋白。圖2 Western-Blotting檢測p-catenin在結腸癌細胞株中的表達。1、 SW48 細胞、HCT116細胞。圖3免疫組化檢測P-catenin在結腸癌組織中的表達。1、正常結腸組織，2.結腸癌組織。
具體實施方式
1 、主要試劑重組小鼠P-catenin蛋白，購自美國MD公司(蛋白含量3.9S g/L， SDS-PAGE分離顯示單一條帶，Mr為92000)。全細胞蛋白提取試劑盒，購自美國Activemotif生物公司。SP試劑盒為 Promega的產 品。細胞株人結腸癌細胞株SW48和HCT116均購自ATCC細胞株庫。 動物Balb/c小鼠，雌性，6—8周齡，20-25 g/只，購自中國醫學科學 院動物研究所。2、 抗p-cateninMcAb雜交瘤細胞的建立將免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，HAT培養液選擇培養IO d， 6塊96孔板中500孔有雜交瘤細胞生長，融合率為90%。融合後第12天，進行 第1次ELISA雙篩選，先將吸出的上清分別與融合蛋白P-catenin和P21包被的 抗原板行EL1SA檢測，選擇P-catenin為陽性而P21為陰性的克隆進行第一次亞 克隆，此後重複進行ELISA篩選及亞克隆3-4次，最後獲得l株能穩定分泌抗 (3-cateninMcAb的雜交瘤細胞株，命名1D3，亞類鑑定為IgG2a。3、 小鼠抗P-catenin單克隆抗體的鑑定 將雜交瘤細胞株擴大培養後收集上清，其效價可達10—5，用Protein A Sepharose-4B柱進行層析純化，純化後抗體效價可達10'6 ， ELISA檢測結果表 明，雜交瘤培養上清，及純化的抗體均能與p-catenin蛋白特異結合。4、 人結腸癌細胞株P—catenin蛋白表達的檢測用Western blot法檢測兩株細胞提取液中P-catenin蛋白的表達。每株細胞取蛋 白各50嗎，用8XSDS. PAGE電泳分離後電轉移至(JPVDF膜上，封閉後，加入 製備並純化的P-catenin抗體(工作濃度l : 2 000)， 4。C過夜.加入HRP標記的 羊抗鼠抗體(工作濃度l : 5000)於37。C反應lh， ECL顯色後觀察結果。5、 結腸組織中p-catenin表達的檢測 組織切片來自外科結腸癌患者手術切除的正常結腸和結腸癌組織標本。病理 組織學觀察按全國結腸癌病理協作組制定的診斷標準作出明確診斷。按 Dukes分期，其中A、 B期22例，C、 D期22例。按常規法作病理切片進行免疫 組化染色。 一抗為自製的兔抗P-catenin，稀釋度為l : 100，並用PBS替代一 抗作為空白對照。DAB顯色，蘇木精復染。結果判定按照國外學者對組織5中p-catenin的判定標準，p-catenin蛋白陽性反應為黃到棕黃色細小顆粒，定 位於細胞漿。 結果-1、 抗P-catenin抗體特異結合f3-catenin重組蛋白P-catenin重組蛋白經8%的SDS-PAGE電泳，將凝膠中的P-catenin轉移至PVDF 膜上，用抗(3-catenin抗體進行免疫染色，出現Mr為92 000左右的條帶(圖1)， 與文獻報導相符，證明此抗體為抗P-catenin的特異性抗體。2、 抗p-catenin抗體在結腸癌細胞株中的應用 從人結腸癌細胞株SW48和HCT116中分別提取細胞總蛋白.用紫外分光光度 法測定其蛋自含量分別為4.78g/L 、 3.97g/L。用製備的抗P-catenin抗體做 免疫印跡檢測，得到兩條特異性條帶，說明這兩種結腸癌細胞株均P-catenin 蛋白表達。3、 p-catenin在結腸癌組織中的表達 應用抗P-catenin抗體對44例正常結腸和結腸癌P-catenin的表達進行 進行了定位分析，結果顯示，(3-catenin在正常結腸組織中表達在細胞膜上.而 在結腸癌組織中有52.17%為陽性表達.並且發現P-catenin在細胞漿中大量表 達，提示結腸癌發生後P-catenin由細胞膜易位入細胞漿。
權利要求
1、一種抗β-catenin單克隆抗體的製備方法，其特徵是應用重組小鼠β—catenin蛋白，免疫Balb/c小鼠，應用雜交瘤技術，通過ELISA雙篩得到1株抗β-catenin單抗1D3，其亞型為IgG2a；步驟為將免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，HAT培養液選擇培養10天，6塊96孔板中500孔有雜交瘤細胞生長，融合率為90％；融合後第12天，進行第1次ELISA雙篩選，先將吸出的上清分別與融合蛋白β-catenin和P21包被的抗原板行EL1SA檢測，選擇β-catenin為陽性而P21為陰性的克隆進行第一次亞克隆，此後重複進行ELISA篩選及亞克隆3-4次，最後獲得1株能穩定分泌抗β-catenin McAb的雜交瘤細胞株，命名1D3，亞類鑑定為IgG2a。
2、 用權利要求l所述方法製備的抗(3-catenin單克隆抗體的在結腸癌病理 檢測中的應用，其特徵是用免疫印跡法Westem blot檢測(3-catenin抗體的純度和特異性以及結腸癌 細胞系SW48和HCT116中卩-catenin蛋白的表達；用免疫組化SP法檢測 卩-catenin在正常結腸組織和結腸癌組織中的不同表達；結果顯示 (1 ) 抗(3-catenin抗體特異結合p-catenin重組蛋白(3-catenin重組蛋白經8 %的SDS-PAGE電泳，將凝膠中的j3-catenin轉移至 PVDF膜上，封閉後，用抗P-catenin抗體進行免疫染色，加入製備並純化的 p-catenin抗體，工作濃度1:2 000, 4。C過夜，加入HRP標記的羊抗鼠抗體， 工作濃度l : 5000，於37'C反應lh，出現Mr為92 000的條帶，與文獻報導相符， 證明此抗體為抗P-catenin的特異性抗體；(2) 抗P-catenin抗體在結腸癌細胞株中的應用 從人結腸癌細胞株SW48和HCT116中分別提取細胞總蛋白，用製備的抗P-catenin抗體做免疫印跡檢測，得到兩條特異性條帶，說明這兩種結腸癌 細胞株均為(3-catenin蛋白表達；(3) (3-catenin在結腸癌組織中的表達 應用抗P-catenin抗體對正常結腸和結腸癌(3-catenin的表達進行定位分析，按常規法作病理切片進行免疫組化染色， 一抗為兔抗P-catenin，稀釋度 為l : 100，並用PBS替代一抗作為空白對照，DAB顯色，蘇木精復染，結果 顯示，(3-catenin在正常結腸組織中表達在細胞膜上，而在結腸癌組織中有 52.17 %為陽性表達，並且發現P-catenin在細胞漿中大量表達，提示結腸癌發 生後(3-catenin由細胞膜易位入細胞漿。
全文摘要
抗β-catenin單克隆抗體製備及在結腸癌病理檢測中的應用，屬於生物醫藥技術領域。本發明應用重組小鼠β-catenin蛋白，免疫Balb/c小鼠，應用雜交瘤技術，通過ELISA雙篩得到1株抗β-catenin單抗1D3，其亞型為IgG2a。用免疫印跡法(Western blot)檢測β-catenin抗體的純度和特異性以及結腸癌細胞系SW48和HCT116中β-catenin蛋白的表達。用免疫組化SP法檢測β-catenin在正常結腸組織和結腸癌組織中的不同表達。本發明製備了高效價、特異性的抗β-catenin單克隆抗體。用該抗體檢測證實，正常結腸組織β-catenin表達在細胞膜中，而結腸癌組織β-catenin則在細胞漿中表達。提示結腸癌發生後β-catenin由細胞膜易位入細胞漿中表達，這可作為結腸癌的診斷的參考指標。
文檔編號C12N15/06GK101532008SQ20091003120
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月29日 優先權日2009年4月29日
發明者朱曉林 申請人:朱曉林