一種新城疫dna疫苗及其構建和應用的製作方法
2023-07-16 21:59:56 1
專利名稱：一種新城疫dna疫苗及其構建和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及DNA疫苗及其構建和應用，特別是涉及一種新城疫病毒pVAX1-LasotaHN DNA疫苗及其構建和應用。
背景技術：
1990年Dr.John Woffer和Dr.Feigner偶然發現，質粒DNA在肌肉細胞中能進行轉化和表達，並推測用DNA注入機體可能產生免疫反應。1992年美國的Robinson實驗室、Johoston實驗室、David實驗室同時開發研究出了DNA疫苗的雛形，並在1992年9月召開的疫苗學新進展大會上同時進行了報告。1992年Tang在Nature上報導，將含有人生長激素基因的質粒DNA導入小鼠，在小鼠血清中檢測到特異抗人生長激素抗體，DNA疫苗的新技術自此問世，並且立刻引起世界各國的高度重視，被人們視為疫苗研究領域的一場革命。1994年美國國家衛生研究院(NIH)以國家生物戰略發展計劃的專項經費資助開展DNA疫苗治療HIV的研究工作。1994年美國FDA批准了在人體進行DNA疫苗治療愛滋病的臨床試驗。1995年5月，報導了世界第一例DNA疫苗的臨床試驗，世界衛生組織(WHO)撥款把DNA疫苗納入WHO全球免疫研製開發計劃之中。
DNA疫苗新技術的核心是將編碼抗原的核酸序列組裝到含有必要表達調控元件的真核表達載體中構建核酸疫苗，然後將其導入動物體內，重組的核酸疫苗可以利用動物體內的酶系合成外源基因編碼的蛋白，從而誘發動物對該外源蛋白產生免疫應答，達到免疫目的。許多動物模型和人體實驗都證明了DNA疫苗能激發有效的體液免疫應答和細胞免疫應答既可激活體液免疫，又能激活細胞免疫，這表明DNA免疫技術，不僅能通過產生抗體預防病毒感染，更重要的是DNA疫苗可誘導極有效的專一性T殺傷細胞的能力，清除已經被感染的機體細胞，達到治療疾病的目的，而且沒有副作用反應。與當前常用的減毒活苗疫苗或滅活菌疫苗相比，DNA疫苗具有明顯的優勢，1)所需的免疫量較小，20-100微克；2)DNA疫苗能同時高效激發體液免疫和細胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更強；3)不僅具有預防疾病的作用而且還有治療疾病功效；4)基因免疫安全、長效(免疫能力有長時間的記憶)、穩定、操作便捷。因此DNA疫苗具有其它免疫方法難以比擬的潛在優勢。其應用前景十分誘人。
雞新城疫，也稱新城疫病毒(Newcastle disease virus，以下簡稱NDV)是國內外養禽業發展的重要制約因素。速髮型新城疫病毒(NDV)是雞群中流行的新城疫病毒毒株。當前，NDV是危害世界養雞業、養鴿業的重要傳染病之一。雞感染新城疫病毒後，目前尚無特殊治療藥物。雛雞疫苗接種是預防的主要措施，目前一般採用的是新城疫病毒減毒活苗或滅活苗作預防疫苗。這種減毒疫苗雖有一定效果，但工藝繁瑣，效果差，每當新城疫病毒流行，雞的死亡率仍是非常之高。此外，這種減毒活苗或滅活苗僅能激活體液免疫，所以只在預防上有一定作用，但無法控制和治療該病毒引起的雞瘟。不能滿足國內外養禽業急需具有高效、安全可靠、有預防作用的雞新城疫疫苗的需求。
發明內容
本發明的目的在於克服現有傳統接種NDV病毒減毒活苗或滅活菌作為預防疫苗，產生的抗體滴度低、免疫效果差、易產生免疫逃避、僅有較弱的預防作用而無治療新城疫的功能等缺陷，從而提供一種能預防和治療新城疫pVAX1-LasotaHN DNA疫苗。
本發明的另一目的是提供該新城疫DNA疫苗的構建。
本發明的再一目的是提供該新城疫DNA疫苗的用途。
本發明的目的是由如下的技術方案實現的本發明提供的新城疫DNA疫苗，該疫苗由NDV-LasotaHN基因和真核表達載體pVAX1組成，其特徵在於所述的NDV-LasotaHN基因是NDV病毒的致病決定基因，其為NDV病毒的Lasota E4基因中第6400至8144的核苷酸，具有圖1中所示的核苷酸序列本發明提供的所述新城疫DNA疫苗的構建，包括如下步驟1)NDV Lasota病毒總RNA的提取及純化將NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的雞胚裡面，待雞胚死亡後，收集尿囊液，按常規方法提取NDV Lasota病毒總RNA；2)設計特異性引物根據Lasota病毒F蛋白基因序列分析設計出一對特異性引物，上遊引物5′-CGACAACAGTCCTCAATCATGG-3′；下遊引物5′-TTGACTCAACTAGCCAGACCTGG-3′；3)通過溫度降落過逆轉錄-聚合酶鏈式擴增方法，克隆得到NDV Lasota HN的全長cDNA基因序列；
4)將步驟3)擴增的LasotaHN，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化LasotaHN cDNA片段；5)將LasotaHN全長cDNA片段重組到pVAX1真核表達質粒中，構建成一種新城疫DNA疫苗——抗NDV的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗。
所述步驟3)的溫度降落逆轉錄-聚合酶鏈式擴增方法包括逆轉錄反應在48℃反應45分鐘，接著在94℃滅活5分鐘，並啟動溫度降落逆轉錄-聚合酶鏈式擴增方法擴增反應在第一個變性步驟時加入聚合酶，變性溫度為94℃，持續1分鐘，退火溫度從68℃開始，持續1分鐘，然後以每四個循環下降1℃的速度降至56℃，持續1分鐘，延伸溫度為65℃，持續1.5分鐘；最後在以退火溫度57℃/分鐘繼續擴增15個循環；最後在71℃延伸10分鐘。
本發明進一步提供了所述新城疫DNA疫苗在製備用於預防雞新城疫疾藥物中的應用。
本發明還提供了所述新城疫DNA疫苗在製備用於治療雞新城疫疾病藥物中的應用。
本發明提供的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗優益之處在於1)所需的免疫量較小，20～50微克即可；2)核酸疫苗能同時高效激發體液免疫和細胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更強；3)不僅具有預防雞新城疫疾病的作用而且還有治療該疾病功效；4)基因免疫安全、長效(免疫能力有長時間的記憶)、穩定、操作便捷。
圖1為NDV-LasotaHN基因的核苷酸序列。
具體實施例方式
本發明實施例中使用的三黃雞由北京昌平養雞廠孵育，來杭雞為北京動物實驗中心孵育。
實施例1.本發明的新城疫DNA疫苗——pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的構建本發明的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的構建步驟如下1)NDV病毒(Virus)總RNA的提取及純化
採用Promega公司RNAgentsTotal RNA Isolation System kit提取NDV Lasota病毒總RNA，其具體操作是將由北京中國獸醫藥品監察所提供的NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的雞胚裡面，在燈光下觀察發現雞胚死亡後，收集尿囊液20ml，將收集的尿囊液以700rpm的速度離心15分鐘；將上清液加入20ml 16wt％PEG-0.525MNaCl，冰浴1小時；以10000rpm的速度離心5分鐘，於4℃沉澱病毒顆粒；用800μl變性液將病毒沉澱溶解，移至1.5ml EP管；加80μl乙酸鈉混勻，加入800μl苯酚∶氯仿∶異戊醇(體積比1∶1∶1)混勻，振動8～12秒，水浴15分鐘；以10000rpm的速度於4℃離心15分鐘，取出上清液；以10000rpm的速度於4℃離心10分鐘；分出沉澱，乾燥後加10μl無核酸酶水，-80℃保存；2)設計特異性引物根據Lasota病毒HN蛋白基因序列分析設計出一對特異性引物，上遊引物5′-CGACAACAGTCCTCAATCATGG-3′；下遊引物5′-TTGACTCAACTAGCCAGACCTGG-3′；3)通過TDRT-PCR(溫度降落逆轉錄-聚合酶鏈式反應)克隆擴增LasotaHN基因全長cDNA50μL的反應體系由10μL的AMV/Tf1 5×反應緩衝液、2mM的dNTPs混合物、3mM的MgSO4、1μM的上遊引物及下遊引物、0.1U/μL的AMV逆轉錄酶、0.1U/μL的Tf1DNA聚合酶，2μg的總RNA和無核酸酶水組成；逆轉錄反應在48℃反應45分鐘，接著在94℃滅活5分鐘，並啟動溫度降落逆轉錄-聚合酶鏈式擴增方法(TDRT-PCR)擴增反應在降落TD-PCR擴增階段，變性溫度為94℃，持續1分鐘，退火溫度從68℃開始，持續1分鐘，然後以每四個循環下降1℃的速度降至56℃，持續1分鐘，延伸溫度為65℃，持續1.5分鐘；最後在以退火溫度57℃分鐘繼續擴增15個循環；最後在71℃延伸10分鐘；4)通過TDRT-PCR擴增的LasotaHN基因cDNA，方法同3)，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化LasotaHN基因cDNA片段；5)將LasotaHN全長cDNA片段重組到pVAX1真核表達質粒中，構建成抗NDV的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗根據pVAX1載體試劑盒的使用說明選用真核質粒表達載體pVAX1含有真核啟動子CMV，能夠在真核細胞中高效表達外源蛋白質，將LasotaHN全長cDNA片段重組到pVAX1真核表達質粒中用連接反應液轉化感受態細胞Top10F』，取80ul轉化的菌液塗布LB(含氨苄青黴素)平板，於37℃培養過夜；挑取菌落搖菌過夜，用鹼裂法提取質粒DNA，即本實施例的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，進行酶切鑑定並對陽性重組質粒進行測序。
實施例2.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗外源LasotaHN基因體外瞬時表達和表達含量的鑑定LasotaHN基因的體外mRNA表達建立HeLa細胞體外瞬時表達系統，將實施例1中構建的真核表達質粒pVAX1-LasotaHN經脂質體轉染到培養在24孔板的HeLa細胞中，於36小時收集細胞，提取36小時收集的轉染HeLa細胞的總RNA，採用RT-PCR方法分析LasotaHN基因的體外表達。通過RT-PCR方法擴增出LasotaHN cDNA條帶，結果表明pVAX1-LasotaHN真核表達質粒在Hela細胞體外瞬時表達系統中在mRNA水平上能高效表達，mRNA水平的表達量比對照組(空質粒)高出157％。
外源LasotaHN的體外蛋白表達採用免疫螢光的方法檢測轉染HeLa細胞LasotaHN蛋白的表達。取轉染36小時的HeLa細胞於4wt％磷酸緩衝液-多聚甲醛(PH7.4)中室溫固定1小時，用磷酸緩衝液(為方便起見，以下簡稱PBS)漂洗3次後，1∶50(為方便起見，本專利所有實施例中的1∶x都是指用PBS物質稀釋x倍的)正常血清室溫封閉分鐘，棄封閉血清，加入50μL 1∶250稀釋的雞抗NDV蛋白抗血清(0.5mg/mL)37℃孵育3小時，經PBS漂洗後，樣品於1∶100稀釋羊抗雞IgG-FITC 4℃孵育1小時，PBS漂洗後用20μg/mL碘化丙啶(PI)在4℃染色2分鐘，PBS漂洗，於雷射共聚焦顯微鏡(Confocal)488nm和564nm激發波長下觀察分析。免疫螢光結果證實pVAX1-LasotaHN能在Hela細胞體外瞬時表達系統中產生具有生物活性的LasotaHN蛋白，蛋白水平的表達量比對照組(空質粒)高164％。
實施例3.在體內pVAX1-LasotaHN DNA疫苗外源LasotaHN基因表達和表達含量的鑑定外源LasotaHN基因的體內表達檢測將北京昌平養雞廠孵育的三黃雞隨機分為2組，每組18隻，一組為實驗組，對三黃雞的肌肉注射實施例1中構建的20μgpVAX1-LasotaHN質粒DNA；另一組為對照組，對三黃雞的肌肉注射20μg pVAX1空質粒DNA。於注射質粒DNA後第3周取免疫三黃雞的肌肉、肝臟和脾臟組織，提取pVAX1-LasotaHN免疫三黃雞收集的肌肉組織、肝臟和脾臟組織總RNA，採用RT-PCR方法檢測外源LasotaHN基因在三黃雞體內的表達情況。由檢測結果可知，pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫後肌肉、肝臟和脾臟組織細胞中LasotaHN在mRNA水平上表達，mRNA水平的平均表達量比對照組(空質粒)高出289％。
實施例4.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗體內免疫反應的檢測ELISA檢測三黃雞體液免疫應答實驗分組、pVAX1-LasotaHN DNA疫苗注射方式及部位都與實施例3相同。用1∶50倍稀釋的正常血清(未射任何質粒)和1∶50倍稀釋的肌肉注射20μg pVAX1空質粒DNA的血清分別作為對照，收集pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫三黃雞三周後的血清按1∶100和1∶500的比例稀釋，以1μg/mL的Lasota E4標準蛋白50μL/孔作包被抗原，採用標準ELISA方法檢測體液免疫應答。由檢測結果可知，pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫後機體能產生高滴度抗體(抗體滴度＞1∶3700)。
實施例5.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的安全性評估對於免疫動物的安全性檢測檢測不同劑量(20μg～300μg)pVAX1-LasotaHNDNA疫苗免疫30隻三黃雞，160天後無一隻死亡；進行不同劑量pVAX1-LasotaHNDNA疫苗注射動物後的毒理性和常規生理指標的觀察測定，利用組織化學方法確定注射疫苗後動物組織病理變化將相應組織器官進行冰凍切片，在顯微鏡下觀察，沒有發現動物組織有病理變化。
實施例6.評估pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫家禽後是否對其他動物產生影響。
20隻孵出三天的三黃雞和20隻孵出三天的來杭雞混養，隨機取10隻注射20μgpVAX1-LasotaHN DNA疫苗並作好標記，6周後，採用RT-PCR方法檢測其它30隻未射任何質粒三黃雞體或來杭雞體內是否有pVAX1-LasotaHN DNA疫苗外源Lasota HN基因的表達，30隻雞的檢測結果顯示未檢到外源LasotaHN基因在mRNA水平的表達，這表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫家禽後對其他未免疫的動物無感染作用。
實施例7.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗在雞群中實際預防和治療雞新城疫的療效實驗-I在北京動物實驗中心孵育36隻白來杭雞雛雞，一周後將雌雄兼有的雛雞隨機分成四組，第1-3組每組8隻，第4組12隻。所注射的新城疫病毒NDV Lasota E4為100μl稀釋100倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液。
第1組不接種任何質粒，3周後注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第2組接種100μl生理鹽水，3周後注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第3組接種20μg pVAX1空質粒，3周後注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第4組接種20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，3周後注射新城疫病毒NDV LasotaE4；從注射新城疫病毒NDV Lasota E4後第三天開始觀察，結果為第1組、第2組、第3組3天後24隻小雞分別出現程度不同的雞瘟症狀，其中8隻死亡；4天後16隻小雞雞瘟症狀加重，其中9隻死亡；5天後7隻小雞僅有1隻存活；6天後1隻小雞亦死亡；第4組3天後12隻小雞無任何雞瘟症狀，健康活潑；4天後12隻小雞無任何雞瘟症狀，健康活潑；5天後12隻小雞無任何雞瘟症狀，健康活潑；6天後4隻小雞出現輕微雞瘟症狀，其餘8隻健康活潑；7天後又有3隻小雞出現輕微雞瘟症狀，其餘5隻健康活潑；10天後其中1隻小雞死亡，其餘11隻健康活潑；120天後11隻小雞均無任何雞瘟症狀，健康活潑；由此實驗結果可知，pVAX1-LasotaHN DNA疫苗具有高效的抗雞新城疫病毒感染的作用，與三組對照組相比抗雞新城疫病毒感染的效果顯著(p＜0.01)。
實施例8.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗在雞群中實際預防和治療雞新城疫的療效實驗-II在北京昌平養雞廠孵育60隻三黃雞雛雞，一周後將雌雄兼有60隻雛雞隨機分成四組，第1～3組每組10隻，第4組30隻。所注射的新城疫病毒NDV Lasota E4為100μl稀釋100倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液。
第1組不接種任何質粒，3周後注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第2組接種100μl生理鹽水，3周後注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第3組接種20μg pVAX1空質粒，3周後注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第4組接種20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，3周後注射新城疫病毒NDV LasotaE4；從注射新城疫病毒NDV Lasota E4後第三天開始觀察，結果為第1組、第2組、第3組3天後30隻小雞均未出現雞瘟症狀，健康活潑；4天後30隻小雞均仍未出現雞瘟症狀，健康活潑；5天後30隻小雞均開始出現雞瘟症狀，且症狀輕重不一；6天後30隻小雞雞瘟症狀加重，其中25隻小雞死亡；7天後其餘5隻小雞雞瘟症狀加重；10天後5隻小雞相繼死亡；第4組3～5天後30隻小雞無任何雞瘟症狀，健康活潑；6～7天後30隻小雞中有8隻小雞出現輕微雞瘟症狀，其它小雞均健康活潑；8～9天後30隻小雞有14隻小雞出現輕微雞瘟症狀，其它小雞均健康活潑；10天後30隻小雞有3隻死亡其它27隻均無任何雞瘟症狀；20天後將存活的27隻小雞再次注射100μl稀釋100倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液；24天後27隻雞中有3隻小雞出現輕微雞瘟症狀，其它雞均健康活潑；28天後3隻小雞出現的雞瘟症狀消失，27隻雞均健康活潑；30天後這27隻雞第三次注射100μl稀釋50倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液；34天後27隻雞健康活潑，均未出現雞瘟症狀；38天後，除1隻死亡外，其它26隻雞均健康活潑。
雞群實驗再次證明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗具有高效的抗雞新城疫病毒感染的作用，與三組對照組相效果十分顯著(p＜0.01)，一旦接受pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫，連續三次用強新城疫病毒NDV Lasota E4病毒株攻擊，雞群均不會被病毒感染，證明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗抗病毒效果穩定、可靠。
實施例9.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗在雞群中實際治療雞新城疫的療效實驗在北京昌平養雞廠孵育30隻三黃雞雛雞，分為三組，每組10隻。
第一組10隻雛雞5天後注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶200)，4～5天後小雞出現輕微雞瘟症狀，此時給每隻小雞注射20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗；接種疫苗後第三至四天小雞新城疫病症狀減弱；第六天後，3隻小雞患病死亡，另7隻小雞症狀未見有明顯變化；第十天後，6隻小雞恢復健康，其餘1隻死亡。
治療實驗表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗具有一定的治療雞瘟的作用，對孵化後一周內的雛雞，強病毒攻擊感染雞瘟後注射pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，療效達60％。
第二組10隻雛雞15天後注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，4～5天後小雞出現雞瘟症狀，此時給每隻小雞注射20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，接種疫苗後3～4天小雞新城疫病症狀明顯減弱；第七天，除3隻小雞死亡外，其它7隻小雞雞瘟症狀減弱；第十天後，7隻小雞完全恢復健康；康復的7隻小雞一周後，再次注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，90天後7隻雞健康活潑，均未出現雞瘟症狀。
第二組治療實驗表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗對孵化後15天遭強病毒攻擊感染雞瘟的小雞療效達70％，且治療雞瘟的同時，還具有良好的預防效果。
第三組10隻雛雞30天後注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，4～5天後雞出現雞瘟症狀，此時給每隻小雞注射20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗，接種疫苗後3～4天小雞新城疫病症狀明顯減弱；第八天，除1隻小雞死亡外，其它9隻雞雞瘟症狀減弱；第十天後，9隻小雞完全恢復健康；康復的9隻小雞一周後，再次注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，90天後9隻雞健康活潑，均未出現雞瘟症狀。
第三組治療實驗表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗對孵化後30天遭強病毒攻擊感染雞瘟的小雞療效達90％。
這三組實驗表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的療效與雞齡大小有一定相關性。
FPI03021-sequence list.txtSEQUENCE LISTING110中國科學院動物研究所120一種新城疫的DNA疫苗及其用途130FPI030211601170PatentIn version 3.121012111744212DNA213Newcastle disease virus4001agtcctcaat catggaccgc gccgttagcc aagttgcgtt agagaatgat gaaagagagg 60caaaaaatac atggcgcttg atattccgga ttgcaatctt attcttaaca gtagtgacct120tggctatatc tgtagcctcc cttttatata gcatgggggc tagcacacct agcgatcttg180taggcatacc gactaggatt tccagggcag aagaaaagat tacatctaca cttggttcca240atcaagatgt agtagatagg atatataagc aagtggccct tgagtctccg ttggcattgt300taaatactga gaccacaatt atgaacgcaa taacatctct ctcttatcag attaatggag360ctgcaaacaa cagtgggtgg ggggcaccta tccatgaccc agattatata ggggggatag420gcaaagaact cattgtagat gatgctagtg atgtcacatc attctatccc tctgcatttc480aagaacatct gaattttatc ccggcgccta ctacaggatc aggttgcact cgaataccct540catttgacat gagtgctacc cattactgct acacccataa tgtaatattg tctggatgca600gagatcactc acattcatat cagtatttag cacttggtgt gctccggaca tctgcaacag660ggagggtatt cttttctact ctgcgttcca tcaacctgga cgacacccaa aatcggaagt720cttgcagtgt gagtgcaact cccctgggtt gtgatatgct gtgctcgaaa gtcacggaga780cagaggaaga agattataac tcagctgtcc ctacgcggat ggtacatggg aggttagggt840tcgacggcca gtaccacgaa aaggacctag atgtcacaac attattcggg gactgggtgg900ccaactaccc aggagtaggg ggtggatctt ttattgacag ccgcgtatgg ttctcagtct960acggagggtt aaaacccaat tcacccagtg acactgtaca ggaagggaaa tatgtgatat 1020acaagcgata caatgacaca tgcccagatg agcaagacta ccagattcga atggccaagt 1080cttcgtataa gcctggacgg tttggtggga aacgcataca gcaggctatc ttatctatca 1140aggtgtcaac atccttaggc gaagacccgg tactgactgt accgcccaac acagtcacac 1200tcatgggggc cgaaggcaga attctcacag tagggacatc tcatttcttg tatcaacgag 1260ggtcatcata cttctctccc gcgttattat atcctatgac agtcagcaac aaaacagcca 1320ctcttcatag tccttataca ttcaatgcct tcactcggcc aggtagtatc ccttgccagg 1380cttcagcaag atgccccaac tcgtgtgtta ctggagtcta tacagatcca tatcccctaa 1440tcttctatag aaaccacacc ttgcgagggg tattcgggac aatgcttgat ggtgtacaag 1500caagacttaa ccctgcgtct gcagtattcg atagcacatc ccgcagtcgc attactcgag 1560tgagttcaag cagtaccaaa gcagcataca caacatcaac ttgttttaaa gtggtcaaga 1620ctaataagac ctattgtctc agcattgctg aaatatctaa tactctcttc ggagaattca 1680gaatcgtccc gttactagtt gagatcctca aagatgacgg ggttagagaa gccaggtctg 1740gcta174權利要求
1.一種新城疫DNA疫苗，該疫苗由NDV-LasotaHN基因和真核表達載體pVAX1組成，其特徵在於所述的NDV-LasotaHN基因是NDV病毒的致病決定基因，其為NDV病毒的Lasota E4基因中第6400至8144的核苷酸，具有圖1中所示的核苷酸序列。
2.一種權利要求1所述的新城疫DNA疫苗的構建，包括如下步驟1)NDV Lasota病毒總RNA的提取及純化將NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的雞胚裡面，待雞胚死亡後，收集尿囊液，按常規方法提取NDV Lasota病毒總RNA；2)設計特異性引物根據Lasota病毒HN蛋白基因序列分析設計出一對特異性引物，上遊引物5′-CGACAACAGTCCTCAATCATGG-3′；下遊引物5′-TTGACTCAACTAGCCAGACCTGG-3′；3)通過溫度降落過逆轉錄-聚合酶鏈式擴增方法，克隆得到NDVLasotaHN的全長cDNA基因序列；4)將步驟3)擴增的LasotaHN，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化LasotaHN cDNA片段；5)將LasotaHN全長cDNA片段重組到pVAX1真核表達質粒中，構建成一種新城疫DNA疫苗——抗NDV的pVAX1-LasotaHNDNA疫苗。
3.如權利要求2所述的新城疫DNA疫苗的構建，其特徵在於所述步驟3)的溫度降落逆轉錄-聚合酶鏈式擴增方法包括逆轉錄反應在48℃反應45分鐘，接著在94℃滅活5分鐘，並啟動溫度降落逆轉錄-聚合酶鏈式擴增方法擴增反應在第一個變性步驟時加入聚合酶，變性溫度為94℃，持續1分鐘，退火溫度從68℃開始，持續1分鐘，然後以每四個循環下降1℃的速度降至56℃，持續1分鐘，延伸溫度為65℃，持續1.5分鐘；最後在以退火溫度57℃/分鐘繼續擴增15個循環；最後在71℃延伸10分鐘。
4.一種權利要求1所述的新城疫DNA疫苗在製備用於預防雞新城疫疾藥物中的應用。
5.一種權利要求1所述的新城疫DNA疫苗在製備用於治療雞新城疫疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及的新城疫DNA疫苗由NDV－LasotaHN基因和真核表達載體pVAX1組成，該DNA疫苗的構建是通過如下步驟NDV Lasota病毒總RNA的提取及純化、設計特異性引物、通過TDRT－PCR擴增，克隆得到NDV LasotaHN的全長cDNA基因序列、將純化後的LasotaHN全長cDNA片段重組到pVAX1真核表達質粒中。與當前常用的疫苗相比，本核酸疫苗達到相同免疫效果所需的量小，並且能同時、高效激發體液免疫和細胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更強，而且安全、長效、穩定、操作便捷。本新城疫DNA疫苗可以用於預防和治療雞新城疫疾的藥物。
文檔編號A61K48/00GK1565630SQ03137560
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月18日 優先權日2003年6月18日
發明者彭景楩, 陳雲, 楊穎 , 孫泉紅, 王金玲 申請人:中國科學院動物研究所