飲用水源水中腸道病毒的檢測方法

2023-07-07 03:53:51 1

飲用水源水中腸道病毒的檢測方法
【專利摘要】一種飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，屬於水質檢測方法領域。該檢測方法，包括以下步驟：（1）水樣處理，（2）水樣濃縮，（3）細胞培養，（4）病毒檢測。本發明所述的檢測方法測定水中腸道病毒含量簡單易行、準確度高、重複性高、檢測極限低，可在環境監測站作為水中腸道病毒含量的測定方法而推廣使用。
【專利說明】飲用水源水中腸道病毒的檢測方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，屬於水質檢測方法領域。

【背景技術】
[0002]隨著生活水平的日益改善，人們對生活飲用水的衛生要求不斷提高。由水傳播的病毒性疾病的流行在許多國家和地區都有報告。為確保飲用水的質量，對水源水和飲用水中腸道病毒的檢測具有重要的現實意義。
[0003]因此，研究一種準確度高、重複性高、操作簡便、檢測極限低的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法很有必要。


【發明內容】

[0004]本發明旨在提供一種準確度高、重複性高、操作簡便、檢測極限低的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法。
[0005]本發明所述的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，包括以下步驟:
(I)水樣處理:用無菌採樣瓶收集水源水樣,將1%體積比的Earl^ s平衡液加入水樣中以促進病毒的吸附，充分混勻，用lmol/L鹽酸調pH為4.5。
[0006](2)水樣濃縮:將一張直徑175mm的濾紙平鋪於175mm直徑的過濾器網板上，用無菌水浸溼，將滑石粉-硅藻土混懸液倒在浸溼的濾紙上，加壓抽濾，使之形成均勻而平整的薄層，然後蓋上兩張直徑相同的濾紙。將處理好的水樣加到吸附層上加壓過濾。待水樣全部通過吸附層後，用30mL的3%牛肉浸膏洗脫液洗脫吸附層上的病毒，抽濾，收集洗脫液。用lmol/L鹽酸調pH至7.2左右。用0.22 μ m的微孔濾膜抽濾除菌，得到水樣濃縮液，置4°C冰箱待用。
[0007](3)細胞培養:將長成單層的Hela細胞生長液倒掉，加入適量的EDTA-胰酶消化液消化，加入適量的生長液，用吸管吹打分散細胞，再用生長液稀釋並分裝於細胞培養瓶中，37°C培養。
[0008](4)病毒檢測:細胞成片後，棄去生長液，加水樣濃縮液，37°C吸附1-2小時，每隔15分鐘振蕩一次；將接種過的細胞倒掉水樣液，加適量的46°C _47°C營養瓊脂平鋪待凝，凝固後37°C翻轉培養48小時，然後用甲醛液固定20分鐘，甩掉瓊脂，自來水衝洗乾淨，再加入結晶紫染色20分鐘，自來水衝洗，觀察空斑並計數，設一瓶空白對照，即細胞不經接種做空斑試驗；通過空斑數量計算病毒濃度。
[0009]優選的，本發明所述的Earle' s平衡鹽液配製方法為A液:取氯化鈉6.Sg、氯化鉀0.4g、硫酸鎂0.2g、磷酸二氫鈉0.125g、葡萄糖lg、碳酸氫鈉Ig溶於800mL 二次蒸餾水中，B液:氯化鈣0.2g溶於150mL 二次蒸餾水中，使用時將B液加到A液中攪拌均勻，4°C保存。
[0010]更優選的，本發明所述的滑石粉-硅藻土混懸液配製方法為取滑石粉2.7g、硅藻土 0.9g加入10mL 二次蒸餾水中混勻後室溫或4°C保存。
[0011]進一步優選的，本發明所述的生長液配製方法為取濃度為1.04%的1640培養液90mL、小牛血清(滅活)10mL、雙抗液ImL混勻後4°C保存。
[0012]更進一步優選的，本發明所述的EDTA-胰酶消化液配製方法為取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.3g、氯化鈉8.0g、氯化鉀0.4g、葡萄糖1.0g、碳酸氫鈉0.5g,0.22 μ m微孔濾膜抽濾除菌，-20°C保存。
[0013]本發明所述的檢測方法中，分為水樣濃縮、細胞培養、病毒檢測三部分。水中病毒濃縮方法有很多種，鑑於有的需昂貴的儀器設備，有的操作繁瑣。本方法採用了適合於一般實驗室條件下開展水病毒檢測的滑石粉-硅藻土濃縮系統，其基本原理是病毒與滑石粉發生電化學作用產生一種可逆性結合，在酸性環境中病毒帶正電荷，易吸附在滑石粉上；在鹼性環境中，用洗脫液能有效地將吸附於滑石粉上的病毒洗脫下來，病毒不能獨立繁殖，必須寄生於細胞內才能增殖。由於病毒在敏感細胞中可使細胞產生病變，並在一定條件下形成蝕斑，所以將待檢水樣接種於敏感細胞中，根據細胞病變效應(CPE)可定性判斷病毒的有無；根據空斑形成單位(PFL)來定量計算水中病毒的含量。
[0014]水中腸道病毒含量的計算公式為 E= ((A/B) XC) /D
其中，E—水中病毒濃度，單位；PFL/L ；A—每瓶空斑數，單位:個PFL;B—接種量，單位:mL ；C—水樣濃縮量，單位:mL ；D—水樣米集量，單位:L
本發明所述的檢測方法中，分為水樣濃縮、細胞培養、病毒檢測三部分，測定水中腸道病毒含量簡單易行、準確度高、重複性高、檢測極限低，可在環境監測站作為水中腸道病毒含量的測定方法而推廣使用。

【具體實施方式】
[0015]實施例一:
配製Earle' s平衡鹽液:A液:取氯化鈉6.8g、氯化鉀0.4g、硫酸鎂0.2g、磷酸二氫鈉
0.125g、葡萄糖lg、碳酸氫鈉Ig溶於800mL 二次蒸懼水中,B液:氯化I丐0.2g溶於150mL 二次蒸餾水中，使用時將B液加到A液中攪拌均勻，40C保存。
[0016]配製滑石粉-硅藻土混懸液:取滑石粉2.7g、硅藻土 0.9g加入10mL 二次蒸餾水中混勾後室溫或4 C保存。
[0017]配製生長液:取濃度為1.04%的1640培養液90mL、小牛血清(滅活)10mL、雙抗液ImL混勻後4°C保存。
[0018]配製EDTA-胰酶消化液:取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.3g、氯化鈉8.0g、氯化鉀0.4g、葡萄糖1.0g、碳酸氫鈉0.5g,0.22 μ m微孔濾膜抽濾除菌，-20°C保存。
[0019]水樣處理:用無菌採樣瓶收集水源水樣，將1%體積比的Earle' s平衡液加入水樣中以促進病毒的吸附，充分混勻，用lmol/L鹽酸調pH為4.5。
[0020]水樣濃縮:將一張直徑175mm的濾紙平鋪於175mm直徑的過濾器網板上，用無菌水浸溼，將滑石粉-硅藻土混懸液倒在浸溼的濾紙上，加壓抽濾，使之形成均勻而平整的薄層，然後蓋上兩張直徑相同的濾紙。將處理好的水樣加到吸附層上加壓過濾。待水樣全部通過吸附層後，用30mL的3%牛肉浸膏洗脫液洗脫吸附層上的病毒，抽濾，收集洗脫液。用lmol/L鹽酸調pH至7.2左右。用0.22 μ m的微孔濾膜抽濾除菌，得到水樣濃縮液，置4°C冰箱待用。
[0021]細胞培養:將長成單層的Hela細胞生長液倒掉，加入適量的EDTA-胰酶消化液消化，加入適量的生長液，用吸管吹打分散細胞，再用生長液稀釋並分裝於細胞培養瓶中，37°C培養。
[0022]病毒檢測:細胞成片後，棄去生長液，加水樣濃縮液，37°C吸附1-2小時，每隔15分鐘振蕩一次；將接種過的細胞倒掉水樣液，加適量的46°C _47°C營養瓊脂平鋪待凝，凝固後37°C翻轉培養48小時，然後用甲醛液固定20分鐘，甩掉瓊脂，自來水衝洗乾淨，再加入結晶紫染色20分鐘，自來水衝洗，觀察空斑並計數，設一瓶空白對照，即細胞不經接種做空斑試驗；通過空斑數量計算病毒濃度。
[0023]水中腸道病毒含量的計算公式為 E= ((A/B) XC) /D
其中，E—水中病毒濃度，單位；PFL/L ；A—每瓶空斑數，單位:個PFL;B—接種量，單位:mL ；C—水樣濃縮量，單位:mL ；D—水樣米集量，單位:L。
【權利要求】
1.飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，包括以下步驟: (1)水樣處理:用無菌採樣瓶收集水源水樣,將1%體積比的Earl^s平衡液加入水樣中以促進病毒的吸附，充分混勻，用lmol/L鹽酸調pH為4.5 ; (2)水樣濃縮:將一張直徑175mm的濾紙平鋪於175mm直徑的過濾器網板上，用無菌水浸溼，將滑石粉-硅藻土混懸液倒在浸溼的濾紙上，加壓抽濾，使之形成均勻而平整的薄層，然後蓋上兩張直徑相同的濾紙，將處理好的水樣加到吸附層上加壓過濾，待水樣全部通過吸附層後，用30mL的3%牛肉浸膏洗脫液洗脫吸附層上的病毒，抽濾，收集洗脫液，用lmol/L鹽酸調pH至7.2左右，用0.22 μ m的微孔濾膜抽濾除菌，得到水樣濃縮液，置4°C冰箱待用； (3)細胞培養:將長成單層的Hela細胞生長液倒掉，加入適量的EDTA-胰酶消化液消化，加入適量的生長液，用吸管吹打分散細胞，再用生長液稀釋並分裝於細胞培養瓶中，37°C培養； (4)病毒檢測:細胞成片後，棄去生長液，加水樣濃縮液，37°C吸附1-2小時，每隔15分鐘振蕩一次；將接種過的細胞倒掉水樣液，加適量的46°C _47°C營養瓊脂平鋪待凝，凝固後37°C翻轉培養48小時，然後用甲醛液固定20分鐘，甩掉瓊脂，自來水衝洗乾淨，再加入結晶紫染色20分鐘，自來水衝洗，觀察空斑並計數，設一瓶空白對照，即細胞不經接種做空斑試驗；通過空斑數量計算病毒濃度。
2.如權利要求1所述的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，其特徵在於所述的Earle' s平衡鹽液配製方法為A液:取氯化鈉6.8g、氯化鉀0.4g、硫酸鎂0.2g、磷酸二氫鈉0.125g、葡萄糖lg、碳酸氫鈉Ig溶於800mL 二次蒸懼水中,B液:氯化I丐0.2g溶於150mL二次蒸餾水中，使用時將B液加到A液中攪拌均勻，40C保存。
3.如權利要求1所述的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，其特徵在於所述的滑石粉-硅藻土混懸液配製方法為取滑石粉2.7g、硅藻土 0.9g加入10mL 二次蒸餾水中混勻後室溫或4°C保存。
4.如權利要求1所述的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，其特徵在於所述的生長液配製方法為取濃度為1.04%的1640培養液90mL、小牛血清(滅活)10mL、雙抗液ImL混勻後4 C保存。
5.如權利要求1所述的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，其特徵在於所述的EDTA-胰酶消化液配製方法為取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.3g、氯化鈉8.0g、氯化鉀0.4g、葡萄糖1.0g、碳酸氫鈉0.5g,0.22 μ m微孔濾膜抽濾除菌，_20°C保存。
【文檔編號】C12Q1/70GK104372107SQ201410496524
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月25日 優先權日:2014年9月25日
【發明者】陸強 申請人:陝西華陸化工環保有限公司