一種虹鱒複合免疫增強劑的製備方法與流程
2023-07-06 16:41:21 2
本發明涉及飼料添加劑，特別涉及一種虹鱒複合免疫增強劑的製備方法。
背景技術：
穀胱甘肽最早由deRey-Palhade於1888年在酵母細胞內發現，它可與硫元素混合後產生硫化氫，廣泛存在於其它活體組織中。穀胱甘肽是由三種胺基酸，即穀氨酸(glutamine)，半胱氨酸(cysteine)及甘氨酸(glycine)所組成的三肽，屬於一種非蛋白質低分子量的硫醇，英文名稱為glutathione(GSH),中文名稱作穀胱甘肽。GSH在自然界中主要存在於酵母、動物肝臟、肌肉及血液裡，許多植物如蔬菜、豆類、穀物、薯類、菇類及細菌內也含有GSH。在還原型穀胱甘肽的分子結構中，半胱氨酸的氨基和穀氨酸的γ-羧基結合，形成穩定的γ-肽鍵，這種結構能夠抵抗細胞內肽酶的水解，使穀胱甘肽具有相對穩定的性質。另外，半胱氨酸上的活性基因巰基(-SH)，賦予了穀胱甘肽多種重要的作用，如促進生長發育、抗氧化、解毒等。
隨著養殖集約化程度的不斷提高，養殖中的應激因子，如營養、環境惡化(氨氮、亞硝酸鹽和pH等)、擁擠等大量湧現，導致水產動物代謝紊亂，抗病力下降，疾病流行和爆發。近年來，隨著研究的不斷深入，發現通過營養調控提高生產效率、提高或激活水產動物自身的抗氧化防禦能力，不僅可克服傳統使用抗生素治療方法存在的缺陷，而且有利於健康養殖，減少對環境的汙染，保證食品安全。同時，在水產養殖中貫徹「防重於治」，如何提高水產動物機體免疫力，提高動物對脅迫的抵抗能力已成為研究的熱點。
穀胱甘肽具有較強的抗氧化、清除自由基能力。GSH的琉基是供氫體,是自由基的清除劑，能保護蛋白免受氧化損傷；它還是GSH-Px酶和GST酶特有的底物,能通過這兩種酶來清除細胞內的自由基和過氧化物,從而維持細胞及組織結構的正常功能和代謝。GSH可參與胺基酸的吸收，促進機體對礦物質鐵、硒、鈣和脂溶性維生素的吸收和轉運。同時，GSH還具有解毒功效。GSH在生物機體內和毒素結合生成可溶性的化合物再經由尿液或腸道排出，許多的致癌物、重金屬、藥品代謝產物、除草劑、殺蟲劑、煙塵及其它汙染物等都由這個途徑轉化成無害物後從身體排出。穀胱甘肽被用於飼料中，通常被人接受的比例是5％-10％。
技術實現要素：
本發明為了提高虹鱒免疫功能及促進生長，提供一種功能專一、適用於集約化虹鱒養殖的免疫增強劑。
為了實現上述目的，本發明是通過以下方案予以實現的。
一種虹鱒複合免疫增強劑的製備方法，包括以下步驟：
(1)採用低溫高壓均質法對麵包酵母進行破壁處理，處理條件為：壓力192MPa，料液比15:100g/mL，循環次數6次，提取溫度14℃；
(2)用葡聚糖酶進行酶解提取，提取條件為：pH5.5，葡聚糖酶/酵母1:4，溫度43℃，時間3h；
(3)提取出穀胱甘肽，用水溶解；
(4)將穀胱甘肽與甘露聚糖、β-葡聚糖依次混合，加入到明膠水溶液中；
(5)採用磁力攪拌器混合均勻；
(6)利用液體後噴塗技術將混合液與維生素、油脂混合添加到虹鱒飼料中，使穀胱甘肽的添加量為飼料總量的0.01％-0.06％。
上述方案中，優選地，步驟(4)中穀胱甘肽、甘露聚糖、β-葡聚糖的質量分數為：穀胱甘肽1-6份，甘露聚糖10份，β-葡聚糖5份。
與已有技術相比，本發明具有以下有益效果：
現有水產或畜禽飼料中免疫增強劑的使用多屬於「外源性」添加，多屬於機體自身不能合成，並具有典型的劑量效應，存在作用機理不明確等特點，導致功效缺乏穩定。所以這種飼料添加劑並不能普遍應用於水產或畜禽的養殖，尤其是一些成本利潤比較高的動物養殖。虹鱒屬經濟價值較高的魚類，市場對功能性添加劑需求較為迫切，提高虹鱒免疫功能及促進生長，能夠滿足養殖實際需求。穀胱甘肽提取方法成熟，無毒、提高免疫力、抗菌抗病毒、無殘留，符合綠色飼料及綠色養殖的要求，是一種全新的天然綠色飼料添加劑，選定該添加比例，是現有技術意想不到的，後續實驗證明該添加比例使虹鱒各項指標達到預料不到的良好效果。
具體實施方式
下面結合附表對本發明的具體實施方式進一步說明：
採用低溫高壓均質法對麵包酵母進行破壁處理，處理條件為：壓力192MPa，料液比15:100g/mL，循環次數6次，提取溫度14℃。破壁處理後，對提取液進行靜置存放60分鐘。採用葡聚糖酶進行酶解提取，提取條件為：pH 5.5，葡聚糖酶/酵母1:4，溫度43℃，時間3h。麵包酵母破壁率為50％，穀胱甘肽提取量為62.4mg/g酵母。
將穀胱甘肽1-6份，甘露聚糖10份，β-葡聚糖5份混合添加至虹鱒配合飼料中。添加過程為：將稱量後的穀胱甘肽、甘露聚糖和β-葡聚糖用少量水溶解，將溶解液加入到一定質量分數的明膠水溶液中，採用磁力攪拌器混合均勻。利用液體後噴塗技術將混合液與維生素、油脂等加入到飼料中。
選擇健康、初始體重為700g左右的實驗魚，隨機平均分成5組，對照組、0.01％添加組、0.02％添加組、0.04％添加組、0.06％添加組。對照組用的是不添加穀胱甘肽的虹鱒飼料；添加組是指將穀胱甘肽按相應比例添加到虹鱒飼料中，各組實驗魚分別用各自飼料養殖8周。實驗開始和結束分別稱重，採集血液、肝臟、脾臟、頭腎等器官稱重，肝臟低溫保存。在實驗中測血清肝臟抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和穀胱甘肽過氧化物酶(GPX)活力和丙二醛(MDA)含量，研究穀胱甘肽對虹鱒生長及免疫機能的影響，各養殖組的實驗結果如表1、2和3所示。
表1穀胱甘肽複合物對虹鱒生長指標的影響
表2穀胱甘肽複合物對虹鱒血清抗氧化反應的影響
表3穀胱甘肽複合物對虹鱒肝臟抗氧化反應的影響
血清肝臟抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和穀胱甘肽過氧化物酶(GPX)活力及丙二醛(MAD)含量的測定採用本領域常規使用的檢測方法或者商品用試劑盒來檢測。
飼料中添加穀胱甘肽複合物後顯著增加虹鱒的特定生長率和增重率，並能降低飼料係數和死亡率(表1)。飼料中添加穀胱甘肽後顯著影響血清和肝臟中SOD、CAT、GPX等活力，但對MDA含量無顯著影響(表2和表3)。
以上所述僅是本發明的基本原理，並非對本發明作任何限制，凡是依據本發明對其進行等同變化和修飾，均在本專利技術保護方案的範疇之內。