一種促進水貂增重的藥物組合物的製作方法

2023-07-22 21:39:31 2

專利名稱：一種促進水貂增重的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物製藥領域中的促增重藥物組合物，特別是涉及ー種促進水貂增重的藥物組合物。
背景技術：
水貂皮具有細密柔軟，手感爽滑，色澤美觀，結實輕巧，又能防潮去溼的優點，用其製成的裘服華貴、保暖、美觀、耐用，因而水貂皮有世界皮毛之冠的美稱，也有人稱其為「軟黃金」。由於水貂的主要經濟價值在其皮毛，因此迫切需要促進水貂增重的藥物，以提高水貂的經濟價值。本發明涉及的Exendin9_39是含有31個胺基酸殘基的小肽，它是由exendin_4的39個胺基酸殘基缺失N端的前8個胺基酸殘基後得到的。Exendin-4發現於美國毒蜥蜴分泌的毒液中(Eng J等，1992)。其作用主要是動物體內的類胰高血糖素樣肽_1(glucagon-like peptide-1, GLP-I)受體的激活劑，促進GLP-1與受體結合，誘導cAMP的產生，從而發揮出類似GLP-I的作用増加葡萄糖依賴性的胰島素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，加速葡萄糖清除，延緩胃排空和誘發飽腹感、抑制食慾，還可以改善外周胰島素抵抗等。而缺少8個胺基酸的Exendin9-39卻是GLP-I受體的抑制劑，其作用也與exendin-4完全相反降低胰島素的分泌、增加胰高血糖素的分泌、増加食慾等(Goke R等，1993 ;Schepp W 等，1994 ;Thorens B 等，1993)。早在 1999 年，Karim Meeran 等用大鼠的實驗證明，exendin9-39能夠提高動物食慾，並能增加動物的體重。他們姆天注射30nmol的exendin9_39於大鼠的側腦室中，連續注射3天,與注射生理鹽水的對照組相比，實驗組大鼠平均每天的飼料消耗是21. 9±0. 5vs. 19. 5±0. 4g，P〈0. 001，最終體重增加(7±2vs. 2±lg，P〈0. 02)。人們可以利用exendin9_39的特性使毛皮動物達到增肥的目的。但exendin9_39化學合成的成本較高。經分析各種文獻和專利，發明人發現與exendin-4有關的國內公開專利有54項、美國專利有51項、歐洲專利有10項，但都與exendin9-39的序列和真核表達無關，關於eXendin9-39基因的優化和真核表達，至今沒有報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種促進狐狸增重的藥物組合物，其有效成分為含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體；該藥物組合物優選為注射劑。所述exendin9_39編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. I所示。所述真核表達載體中eXendin9-39編碼基因的5』端緊密連結有人生長激素的信號肽編碼序列，所述人生長激素的信號肽編碼序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。所述5』端緊密連結有人生長激素的信號肽編碼序列的eXendin9-39編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示。用於構建所述含有eXendin9-39編碼基因的真核表達載體的出發載體為pVAXl(Invitrogen 公司)、pSilencel. 0-U6 (Ambion, Austin, TX, USA)、pEGFP-Nl (ClonTech 公司)、pCMV (Stratagene 公司)、pSV40 (Marker Gene 公司)、pSI、pCI、pCI_neo (Promega 公司)、pPICZa、pTEFl、pcDNA3. I 或 pcDNA (Invitrogen 公司)；其中，優選 pVAXl，以 pVAXl 為出發載體構建的含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體為pVAXl-EXMK。上述重組表達載體均可按照常規方法構建。所述注射劑中含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體的濃度為100-200 μ g/ml ο所述注射劑的溶劑的選擇是多種多樣的，如pH 7. 5-8. 5的TE緩衝液、生理鹽水、PBS或滅菌蒸餾水等，優選為pH 7. 5-8. 5的TE緩衝液。 需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、吸收促進劑、表面活性劑等。上述藥物一般在10月份應用於水貂肌肉注射，用量為每隻水貂注射3_5ml，根據增重情況，可適時追加注射一次，直至11月中下旬水貂取皮。劑量和療程都可調整。為提高療效，本發明的藥物還可以與抗生素、免疫刺激劑等進行組合治療。本發明提供一種促進水貂增重的藥物組合物。該藥物組合物的活性成分為含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體，將其導入水貂體內，可使exendin9_39編碼基因在水貂體內進行表達，從而達到促進水貂增重的目的，以期獲得質優價廉的貂皮。本發明的藥物組合物具有以下優點I)與傳統的優化水貂飼料配方和從飼養管理等角度出發研究的促進水貂增重的方法相比，本發明的藥物組合物具有成本低、起效快的優點。2)該藥物組合物嚴格按照基因藥物生產標準進行製備及純化，具有較高的使用安全性，且經過動物試驗結果表明，該藥物無任何毒、副作用。3)貂皮僅供人類穿戴，動物屍體一般進行銷毀或用於生產エ業用油，故不存在藥物的安全性問題肌肉注射的藥物組合物即使有殘留也只會殘留在肌肉中，退ー步講，如果本發明的藥物在毛皮內有殘留，也不會對人類健康造成威脅，因為水貂毛皮只被製成大衣或帽子等，不與人體直接接觸。4)本發明的藥物組合物可利用工程菌發酵培育獲得，培養及純化方法簡單，成本低廉，對設備要求低，便於進行エ廠化生產。本發明將在水貂及其他毛皮動物的養殖中發揮重要作用，應用前景廣闊。


圖I為含有exendin9_39編碼基因的真核表達載體pVAXl-EXMK的物理圖譜。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見《Molecular Cloning:A LaboratoryManual)) (Sambrook, J. , Russell, David W·，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdedition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所有引物及DNA序列均由上海生工合成。實施例I製備促進水貂增重的藥物組合物
本發明促進水貂增重的藥物組合物的製備過程，包括如下步驟I)人工設計合成5』端緊密連結有人生長激素的信號肽編碼序列的eXendin9-39編碼基因的核苷酸序列Exendin9-39的胺基酸序列如下NH2-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Giy-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser—COOHo根據遺傳密碼錶，並考慮到水貂密碼子的偏愛性，我們設計推導出eXendin9-39基因的真核表達編碼序列為ATGGACCTGTCCAAGCAGATGGAGGAGGAGGCCGTGCGGCTGTTCATCGAGTGGCTGAAGAACGGCGGC CCCTCCTCCGGCGCCCCCCCCCCCTCCTGA (SEQ ID No. I 所示)。而exendin-4失去N端的前8個胺基酸後的核苷酸序列為GACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCG。(Chen YE 等，1997)。相比之下,我們設計的exendin9_39的核苷酸序列與exendin-4的核苷酸序列顯著不同，二者的同源性僅有74. 44%。為促進exendin9_39編碼基因的表達，我們在其5』端緊密連結上人生長激素的信號肽編碼序列(SEQ ID No. 2所示)，人工設計合成5』端緊密連結有人生長激素的信號肽編碼序列的exendin9-39編碼基因的核苷酸序列(並攜帶Hind III和BamH I酶切位點),其完整的表達框序列如SEQ ID No. 3所示。2)真核表達載體pVAXl-EXMK的構建將步驟I)合成的核苷酸序列經Hind III和BamH I酶切後直接克隆入酶切後的PVAXI (購自北京中創先鋒科技有限責任公司，為invitrogen公司產品)中，構建成含有exendin9-39的真核表達載體，命名為pVAXl-EXMK。3)促進水貂增重的藥物組合物的獲得將步驟2)構建的真核表達載體pVAXl-EXMK轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，篩選陽性克隆，將陽性克隆接種於LB培養基中，37°C下發酵培養16-18小吋，發酵結束後收集菌體，離心，棄上清，提取pVAXl-EXMK質粒DNA，用聚こニ醇沉澱法進行純化，檢測0D26(l/0D28(l比值為1.9:1，符合標準；再將pVAXl-EXMK質粒DNA溶解於TE緩衝液中(含終濃度IOmmol/L Tris-Cl和lmmol/L EDTA的溶液，pH值為8. 0)，得到促進水貂增重的藥物組合物(可根據需要調整pVAXl-EXMK質粒DNA和TE緩衝液的混合比例，得到不同濃度的藥物組合物，如將100 μ g的pVAXl-EXMK質粒DNA和ImlpH值為8. O的TE緩衝液混合均勻，即得到濃度為100 μ g/ml的促進水貂增重的藥物組合物)。實施例2安全性試驗(I)毒性試驗將500yg pVAX I-EXMK 質粒 DNA 溶解在 Iml TE 緩衝液(pH 值 8. 0)中，配成 500 μ g/ml的藥物組合物，尾部靜脈注射10隻實驗小鼠，注射後連續觀察5天，10隻小鼠均未出現不良反應和死亡現象。將10. Omg pVAXl-EXMK 質粒 DNA 溶解在 Iml TE 緩衝液(pH 值 8. O)中，配成 IOmg/ml的藥物組合物，對10隻成年貂進行肌肉注射，注射後連續觀察30天，均未出現體溫升高和異常臨床表現。上述試驗結果表明，注射本發明的促進水貂增重的藥物組合物具有較高的安全性。(2)藥物殘留檢測將10. Omg pVAXl-EXMK 質粒 DNA 溶解在 Iml TE 緩衝液(pH 值 8. O)中，配成 IOmg/ml的藥物組合物，對14隻成年貂進行肌肉注射，取治療後水貂腿部肌肉進行藥物組合物殘留檢測，連續檢測14天，結果僅在注射後第3天PCR檢測為陽性，證明本發明藥物的殘留量較低。實施例3藥效實驗
隨機選取成年水貂40隻，公母各半，隨機分為4組，每組10隻，公母各5隻。第I組腿部肌肉注射pVAXl-EXMK質粒DNA濃度為200 μ g/ml的促進水貂增重藥物組合物5ml ;第2組腿部肌肉注射pVAXl-EXMK質粒DNA濃度為400 μ g/ml的促進水貂增重藥物組合物5ml ;第3組腿部肌肉注射pVAXl-EXMK質粒DNA濃度為1000 μ g/ml的促進水貂增重藥物組合物5ml ;第4組注射TE緩衝液(pH值8. O) 5ml。用藥前和屠宰前分別稱重，對數據進行統計分析，綜合判定藥效。與第4組對照組相比，第1、2、3組的平均增重分別為483±0. 5g、350±0. 7g、312±0. 4g。上述結果證明，本發明的藥物組合物對水貂的增重有明顯的效果。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作ー些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
權利要求
1.一種促進水貂增重的藥物組合物，其有效成分為含有eXendin9-39編碼基因的真核表達載體。
2.根據權利要求I所述的藥物組合物，其特徵在於，所述eXendin9-39編碼基因具有SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求I所述的藥物組合物，其特徵在於，所述真核表達載體中exendin9-39編碼基因的5』端緊密連結有人生長激素的信號肽編碼序列，所述人生長激素的信號肽編碼序列如序列表中SEQID No. 2所示。
4.根據權利要求1-3任一項所述的藥物組合物，其特徵在於，所述真核表達載體含有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。
5.根據權利要求I所述的藥物組合物，其特徵在於，用於構建所述真核表達載體的出發載體為 PVAXK pSilencel. 0-U6、pEGFP-Nl、pCMV、pSV40、pSI、pCI、pCI-neo、pPICZa、pTEFl、pcDNA3. I 或pcDNA。
6.根據權利要求5所述的藥物組合物，其特徵在於，所述出發載體為pVAXl。
7.根據權利要求6所述的藥物組合物，其特徵在於，所述真核表達載體為pVAXl-EXMK。
8.根據權利要求I所述的藥物組合物，其為100-200μ g/ml濃度含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體的注射劑。
9.根據權利要求8所述的藥物組合物，其特徵在於，所述注射劑的介質為pH7.5-8.5的TE緩衝液、生理鹽水或PBS。
全文摘要
本發明提供了一種促進水貂增重的藥物組合物，具體是以含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體為有效成分的注射劑。通過將該藥物組合物導入水貂體內，可使exendin9-39編碼基因在水貂體內進行表達，促進水貂增重，從而獲得質優價廉的貂皮。本發明的藥物組合物具有以下優點成本低、起效快；通過該藥物組合物增重獲得的貂皮僅供人類穿戴，不存在藥物的安全性問題；該藥物組合物可利用工程菌發酵獲得，方法簡單、對設備要求低，便於進行工廠化生產。
文檔編號A61P43/00GK102688504SQ20121021199
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者劉維全, 王吉貴 申請人:中國農業大學