一種口腔微生物群落資料庫及其應用的製作方法

2023-07-22 21:26:36 1

專利名稱：一種口腔微生物群落資料庫及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及人體共生菌群和公共衛生領域，具體的講是通過新一代高通量測序技術，得到人體口腔系統以唾液微生物群落為代表的口腔共生菌群相關的物種和基因組信 息，針對不同健康狀態人群建立的一種口腔微生物群落資料庫及其在疾病風險評估、預測 和診斷中的應用。
背景技術：
作為人類健康的一個重要組成部分的口腔健康，在很大程度上影響生活質量，因 此口腔疾病的預防非常重要。口腔疾病，如齲齒、牙周病、口腔黏膜病、口腔癌、HIV的口腔 表現、走馬疳和口腔頌面外傷，均為重要的公共衛生問題。由於疼痛難忍、功能損害和生活 質量下降，口腔疾病對個體和社區的影響不容忽視。世界衛生組織一直致力於在全世界範 圍喚起人們對口腔健康的廣泛重視，呼籲和指導各國政府、社會各界和個人採取切實有效 的措施預防口腔疾病的發生，旨在提高全人類口腔健康水平。如何提高口腔健康水平，不僅僅是在疾病發生之後給予補救性治療措施，更重要 的是尋找疾病的病因所在，開展疾病的預防和防控工作，篩選疾病敏感人群，開展有效的早 期預防、早期診斷及早期治療。越來越多的研究使人們逐步認識到人體疾病與健康狀態 的相互轉化不僅取決於人類自身染色體所攜帶的遺傳基因，還取決於人體內大量共生菌群 間以及與人體自身的相互作用。Peterson等學者研究認為(Peterson，J.，S. Garges, et al. (2009). 「 The NIH Human Microbiome Project. 「 Genome Res 19(12) :2317_2323)， 人個體所攜帶的共生菌群數量遠遠超過構成人體本身細胞的十倍之多，共生菌群基因組理 論的誕生將「人」的含義加以延伸至人類個體所攜帶的微生物群落，正是這些共生菌群賦予 人類不依賴於自身進化而獲得的複雜個體特徵。如此「人」可被定義為人體細胞和微生物 細胞的共生組合體，攜帶兩套基因組，一套是從垂直關係遺傳自父母的人類基因組，其編碼 大約2. 5萬個基因；另一套則是出生後才寄生於人體的大量共生菌群，作為人體的第二基 因組，是後天稟賦的主要承載者，其遺傳信息的總和被稱為「微生物組」，也可稱為「元基因 組」，它所編碼的基因數量在100萬個左右。兩套基因組相互協調、和諧一致，維繫了人體的 健康。為全面分析人體微生物群系，揭示人體健康疾病狀態與人體微生物群系的關係，美 國國立衛生研究院(NIH)於2007年12月19日宣布正式啟動一項新的基因工程-人體共 生菌群基因組計劃(HMP)，對人體內5種已知為微生物群落寄生的區域，包括消化道、口腔、 皮膚、鼻腔和女性泌尿生殖道系統的微生物進行表徵分析，確定個體之間是否有共同的核 心人微生物群系的存在，從而加深對人體微生物群系的變化是否與人體健康狀況相關的理 解，並構建微生物在人體特定區域的存在及變化情況與特定的疾病之間的聯繫。

發明內容
本發明的目的在於提供一種口腔微生物群落資料庫，率先對口腔系統微生物菌群 進行分析。本資料庫是採用454和Solexa新一代高通量測序技術，對不同人群、不同健康狀態來源的口腔唾液微生物進行16S rRNA和全基因組測序，通過超級計算機運算，構建的可 以用於人體疾病風險預測和診斷的口腔微生物菌群資料庫。該資料庫涵蓋了生物系統進化 樹上從細菌、真菌和病毒門到屬等不同層面的物種信息，且幾乎覆蓋所有菌種全基因組的、 具有詳細注釋的功能基因，計算機存儲數據量高達105G以上。該結果使人們對口腔細菌種 類的認識達到了前所未有的深度，提供了更多疾病研究、預測和診斷的候選基因和切入點。具體地說，本發明提供的口腔微生物群落資料庫，是以不同健康狀況人群口腔唾 液為資料庫樣品來源，通過DNA的提取，聚合酶鏈式反應擴增和高通量測序，得到樣品唾液 微生物群落及其基因組信息，通過計算機進行數據的更新和維護。所述的口腔微生物群落資料庫，其中，人群包括成人、兒童、老齡人群以及特殊疾 病來源人群；人群健康狀態包括完全健康、齲病、牙周病、牙髓病、口臭、難治性根尖炎、糖 尿病、腫瘤放療化療後病人、愛滋病、結核病和病毒性肝炎。所述的口腔微生物群落資料庫，其中，唾液微生物群落特徵包括口腔細菌、真菌和病毒。所述的口腔微生物群落資料庫，其中，口腔微生物基因組信息採用454和Solexa 高通量測序儀得到。所述的口腔微生物群落資料庫，其中，基因組信息涵蓋針對每一種口腔微生物核 糖體的16S、18SrDNA序列和所有微生物的宏基因組序列。本發明所構建的資料庫可以應用在臨床口腔疾病、愛滋病、結核、病毒性肝炎、肥 胖和糖尿病的風險評估、預測和輔助診斷中。
具體實施例方式本發明提供的口腔微生物群落資料庫，是通過收集各種不同疾病來源(如齲病、 牙周病、難治性根尖炎等)、不同健康狀態人群的唾液樣品，通過構建16S rDNA、18S rDNA標 籤序列文庫和全基因組文庫，藉助高通量測序手段，構建針對各樣品的唾液微生物群落數 據庫信息，主要包括以下步驟(以下以齲敏感人群為對象示例)1)收集不同人群唾液，然後利用裂解緩衝液(50mM Tris，pH8. 0, 50mMEDTA, 50mM sucrose, lOOmM NaCl,l%SDS)裂解細胞，採用目前已經公知的高鹽法提取唾液中微生物的 全基因組DNA(gDNA)。2)對於16S rDNA標籤序列文庫，通過合成帶有6個鹼基的樣品特異標記的PCR探 針，採用公知的聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增樣品DNA的16S高變區片段，然後將PCR產 物提純後建庫，利用454上機測序。3)通過對比 RDP 資料庫(The Ribosomal Database Project, http://rdp. cme. msu. edu/，其內包含有不斷更新的涵蓋細菌和古菌域的核糖體相關數據，含有大約 1358，426條序列信息截止2010年1月)，同時利用相對成熟的聯合分析流程(主要包括 商業軟體MOTHUR、ULUST、CD-HIT、RDP-CLASSIFIER等)，藉助超級計算機(主要有曙光天潮 TC2600刀片伺服器、天闊A950r-F機架伺服器和天闊A620r_FX機架伺服器組成，總計算能 力達每秒3. 6萬億次)獲得樣品的物種多樣性和豐度信息。4)對於全基因組(或宏基因組)資料庫，直接將PCR產物提純後建庫，通過特異性 標i己，禾IJ用 Solexa上機IlJ序。通過比對KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes,http://www.genome.jp/kegg/)， CAZyme(Carbohydrate-Active enZYmes Database, http://www. cazy. org/)等大型的全基因組及代謝途徑資料庫，進行相關代謝途徑的重建 以及功能基因的注釋和分析。5)在上述研究基礎上構建唾液微生物群落資料庫，該資料庫含有不同人群口腔樣 品所有微生物菌群(包括各菌群的多樣性及豐度)及其對應的16S rDNA和全基因組信息。按照以上步驟，是本領域技術人員能夠實現的。本發明基於對口腔菌群深入了解的基礎上構建的針對特異性疾病及健康人群的 唾液菌群資料庫，該資料庫可用於疾病微生物病因學因素的探討，探尋疾病可能的生物篩 選標誌以及預後判斷指標，利於發現疾病內部與局部菌群之間的隱秘關係。以下舉實施例作進--步的描述。
實施例1
1、高鹽法提取唾液DNA
1)加30iU的蛋白酶K和150 ill的10% SDS到唾液-緩衝液中，53°C水浴中過夜培養。
2)加入400 ill的5M NaCl並冰上培養lOmin, 13，OOOrpm高速離心lOmin,取上清液。
3)加入800 u 1異丙醇，室溫下培養lOmin, 13，OOOrpm高速離心15min。
4)棄上清液，採用500 u 1 70%乙醇洗沉澱三次，溶於30 ill的EB溶液。
2、16S rDNA標籤序列文庫的構建
1)採用帶有獨特標記的引物擴增V4-V5高變區
50 u 1PCR體系包括
lOxbuffer5u 1
dNTP4u 1
DNA polymerase0. 25u 1
H2036. 75 u 1
Primer pair1 u 1*2
template 2 y 1
PCR反應條件
94°C，5min
formula see original document page 572°C, lOmin2)切膠回收提純PCR產物，不同樣品以等摩爾數混合3)按照454FLX Titanium測序標準流程建庫(包括末端補平，接頭連接，小片端去 除，DNA庫固定，填充空缺以及單鏈DNA庫的分離)4)按照454FLX Titanium測序標準操作上機測序(包括乳化PCR擴增，珠子的回收和富集以及測序引物的連結後上機測序)3、對於全基因組(或宏基因組)資料庫，樣品DNA經提純後直接按照Solexa GA II 標準建庫流程建庫(包括氮氣打斷，末端補平，兩端添加接頭，切膠回收300-400bp片段後 PCR擴增)，將構建的DNA文庫在ClusterStation上種植於Flow cell後，經橋式PCR擴增 並雜交測序引物後，SolexaGA II上機測序。4、數據分析16S rDNA 序列1)將原始數據進行質量篩選(依據測序得出的質量評估值，長度，模糊鹼基，可能 的嵌合體的標準進行初步篩選)2)對篩選後的序列進行0TU分析(Operational Taxonomy Unit)，統計菌種多樣
性f曰息。3)對篩選後的序列進行物種鑑定，研究各個分類水平細菌的種類及豐度，尋找在 疾病樣品和健康樣品中從細菌門到細菌屬等不同分類水平上菌種豐度的統計學差異；對於 疾病和健康來源的樣品，基於整個微生物群落的種系發育信息進行Unifrac(http://bmf2. Colorado, edu/unifrac/index. psp)分析，比較群落結構差異，基於上述基礎對疾病的監測 和篩查指標進行歸類。全基因組(或宏基因組)數據1)宏基因組數據的初步篩選(去除含有模糊鹼基的序列)，通過與人的參考基因 組比較去除人基因組來源序列2)與代謝資料庫包括KEGG，CAZyme等代謝資料庫比對，進行序列的注釋，重建相 應的代謝途徑以及功能基因差異的比較。5、由於口腔微生物涵蓋的細菌種群複雜，基因組信息也很龐大。目前該資料庫已 經通過超級計算機進行數據的更新、維護和後臺管理。該資料庫信息的訪問採用基於付費 制度的用戶名和密碼方式登錄。登錄網站為www. microbialdb. org。以上是結合具體實施例子對本發明所做的進一步描述。本領域技術人員應該了 解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理， 在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都 落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由權利要求書及其等效物界定。
權利要求
一種口腔微生物群落資料庫，是以不同健康狀況人群口腔唾液為資料庫樣品來源，通過DNA的提取，聚合酶鏈式反應擴增和高通量測序，得到樣品唾液微生物群落及其基因組信息，通過計算機進行數據的更新和維護。
2.根據權利要求1所述的口腔微生物群落資料庫，其中，人群包括成人、兒童、老齡人 群以及特殊疾病來源人群；人群健康狀態包括完全健康、齲病、牙周病、牙髓病、口臭、難 治性根尖炎、糖尿病、腫瘤放療化療後病人、愛滋病、結核病和病毒性肝炎。
3.根據權利要求1所述的口腔微生物群落資料庫，其中，唾液微生物群落特徵包括口 腔細菌、真菌和病毒。
4.根據權利要求1所述的口腔微生物群落資料庫，其中的口腔微生物基因組信息採用 454和Solexa高通量測序儀得到。
5.根據權利要求4所述的口腔微生物群落資料庫，其中的基因組信息涵蓋針對每一種 口腔微生物核糖體的16S、18SrDNA序列和所有微生物的宏基因組序列。
6.權利要求1所構建的資料庫在臨床口腔疾病、愛滋病、結核、病毒性肝炎、肥胖和糖 尿病的風險評估、預測和輔助診斷中的應用。
全文摘要
一種口腔微生物群落資料庫，是以不同健康狀況人群口腔唾液為資料庫樣品來源，通過DNA的提取，聚合酶鏈式反應擴增和高通量測序，得到樣品唾液微生物群落及其基因組信息，通過計算機進行數據的更新和維護。該資料庫可用於深入分析各類人群口腔微生物群落結構組成；用於疾病微生物病因學因素的風險評估、預測和人體健康狀況評價。也可以用於篩選疾病診斷的生物標誌以及預後判斷指標。
文檔編號G06F19/00GK101833613SQ20101019822
公開日2010年9月15日 申請日期2010年6月4日 優先權日2010年6月4日
發明者凌均棨, 宋厚輝, 徐健, 曾曉維, 楊芳, 王瑋 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所