一種生產鴨疫裡氏桿菌疫苗用菌液的方法
2023-07-22 18:14:56 1
專利名稱：一種生產鴨疫裡氏桿菌疫苗用菌液的方法
技術領域：
本發明涉及獸用生物製劑技術領域，特別涉及一種生產鴨疫裡氏桿菌疫苗用菌液 的方法。
背景技術：
鴨傳染性漿膜炎是發生於家鴨、鵝、火雞和多種禽類的一種接觸性傳染病，又稱鴨 疫裡默氏桿菌病、鴨疫巴氏桿菌病、鴨敗血症、鴨疫綜合症、鴨疫敗血症和新鴨病，其病原為 鴨疫裡默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA)。該病呈急性敗血症或慢性感染，臨床 上主要表現為咳嗽、喘氣、下痢、眼鼻分泌物增多、共濟失調和頭頸震顫，少數慢性病例出現 頭頸歪斜等症狀；典型病變為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎和乾酪性輸卵管炎。 該病一年四季均可發生，以冬季發病嚴重，主要經汙染的飼料、飲水、飛沫等傳播；1-8周齡 的鴨高度敏感，尤以2-3周齡的雛鴨發病率較高，可達90% ；死亡率受多種因素的影響，差 別較大，常為10-20%，但也有的高達60-75%。應激因素如飼養密度過大、通風不暢、衛生 條件差、氣候突變等，可誘發該病的發生，死亡率大大提高；耐過鴨可表現神經症狀，生長發 育緩慢、消瘦，飼料報酬下降，嚴重影響生產成績，造成嚴重的經濟損失。鴨傳染性漿膜炎是目前對世界各國養鴨業造成危害最為嚴重的傳染病之一，在世 界範圍內分布，幾乎在所有採用集約化養鴨生產的國家都有發現，給世界養鴨業造成了巨 大的經濟損失。我國是一個養鴨大國，養鴨業在我國的農業經濟中佔有著重要的地位，也是 人們生活所需肉蛋的重要來源之一，鴨傳染性漿膜炎在我國各養鴨地區的流行較嚴重，是 我國養鴨場(特別是商品鴨場)最難於對付、造成養鴨業經濟損失的最主要傳染病之一，加 之RA的耐藥性逐漸增強，給我國養鴨業造成了巨大經濟損失。由於RA病給養鴨業帶來嚴重的經濟損失，有關其免疫預防研究引起了越來越多 的關注。儘管RA血清型較多，各型之間基本無交叉保護作用，給疫苗的研製帶來了較大的 困難，但關於RA疫苗的研究，還是引起了獸用生物製品領域科研人員的廣泛關注並認為鴨 疫裡默氏菌預防的根本措施還是接種疫苗。目前研究報導的RA疫苗主要有RA滅活疫苗 (只有一種血清型的單價滅活疫苗、含多種血清型的多價滅活疫苗)、RA和E. coli 二聯滅 活疫苗、RA弱毒活疫苗、提取獲得RA亞單位成分的亞單位疫苗。其中滅活疫苗效果確實， 就目前研究進展來說是鴨疫裡默氏菌預防最好的選擇。大規模發酵生產鴨疫裡默氏菌菌液 是鴨疫裡氏桿菌滅活疫苗生產的基礎和關鍵之一，但目前未有工廠化大規模發酵生產鴨疫 裡氏桿菌滅活疫苗菌液的發酵工藝。
發明內容
本發明的目的在於提供一種生產鴨疫裡氏桿菌疫苗用菌液的方法，特別涉及工廠 化大規模發酵生產鴨疫裡氏桿菌菌液的工藝。本發明採用以下技術方案—種生產鴨疫裡氏桿菌疫苗用菌液的方法，包括一級種子的繁殖與鑑定、二級種子的繁殖、發酵；所述的一級種子的繁殖與鑑定為將凍幹基礎菌種接入含10%犢牛血清 的營養肉湯，37°C培養24小時；然後劃線接種在含10%犢牛血清營養瓊脂平板上，在含 5 10% CO2或者燭缸的環境中，經37°C、24 48小時培養後選典型菌落接種含10%犢牛 血清營養瓊脂斜面若干支，置37°C、5-10% C02或者燭缸環境下培養24小時，作為一級種 子；所述的二級種子繁殖為取一級種子接種於含10%犢牛血清的營養肉湯，置37°C培養 24小時，取樣作純粹檢驗合格後，置2 8°C保存，使用期不得超過5日；所述的發酵，發酵 所用的培養基為含裂解全血的N-J合成培養基；發酵的菌種接種量為按培養基量的 2%接種二級種子液；發酵方式為培養罐液體發酵培養；培養條件為37°C連續培養24小 時。所述的生產鴨疫裡氏桿菌疫苗用菌液的方法，所述含裂解全血的N-J合成培 養基包括基礎培養基和添加物，所述基礎培養基的組分及比例為胰蛋白腖，1.5-1. 9% ；酵 母提取物，0. 2-0. 7% ；牛肉浸膏，0. 2-0. 7% ；水解乳蛋白，0. 2-0. 7% ；葡萄糖，0. 1-0. 4% ； NaCl,0. 5% ；磷酸二氫鉀，0. 1-0. 7% ；磷酸氫二鉀，0. 1-0. 7% ；Na2HP04 · 12Η20，0· 5-0. 9% ； (NH4)2S04，0. 1-0.2% ；NH4C1,0. 01-0. 03% ；其中所述各組分的百分比為重量/體積百分 比；所述添加物為採用頸靜脈採血或頸動脈放血的方法無菌採取非疫區健壯牛血並無菌脫 纖，於-20°C和室溫凍融，反覆凍融3次後，保存於-20°C備用或採血並無菌脫纖後直接保存 於-20°C，使用前取出反覆凍融3次；裂解血球全血按體積比加入基礎培養基中。本發明的工廠化大規模發酵生產鴨疫裡氏桿菌的工藝已經實驗室檢測、中試和生 產應用，表明具有良好的效果。
具體實施例方式以下結合附圖
和具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例11 %裂解血球全血N-J合成培養基製備配置IOOml的裂解血球全血N-J合成培養基胰蛋白腖1.9g ；酵母提取物 0. 7g;牛肉浸膏0. 7g;水解乳蛋白0. 7g;葡萄糖0. 4g ；NaCl 0. 5g ；磷酸二氫鉀0. 3g ； 磷酸氫二鉀0. 3g ；Na2HPO4 · 12H20 0. 9g ； (NH4)2SO4 0. 2g ；NH4Cl 0. 03g ；水加至 IOOmL ；將 上述各組分121°C滅菌15分鐘，待滅菌成分冷卻至低於40°C時，然後向上述基礎培養基中 加入添加物裂解血球全血Iml ；搖勻後即得成品N-J合成培養基。所述添加物裂解血球全血為採用頸靜脈採血或頸動脈放血的方法無菌採取非疫 區健壯牛血並無菌脫纖，於-20°C和室溫凍融，反覆凍融3次後，保存於-20°C備用或採血並 無菌脫纖後直接保存於-20°C，使用前取出反覆凍融3次製得。實施例2鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗制苗菌液的製備1菌種血清I型鴨疫裡默氏桿菌RA-CH-I株。2培養基 裂解血球全血N-J合成培養基、10%血清營養瓊脂平板、裂解全血 及檢驗用培養基均嚴格按《中國獸藥典》附錄進行生產和檢驗合格後備用。3 方法3. 1 一級種子的繁殖與鑑定
將凍幹的血清I型鴨疫裡默氏桿菌RA-CH-I株基礎菌種接入5ml含10%犢牛血清 的營養肉湯中，37°C培養24小時；然後劃線接種在2個含10%犢牛血清營養瓊脂平板上， 按標準表面光滑、稍突起、圓形、呈奶油狀的菌落，菌落直徑1. 2 1. 7mm ；菌塗片可見到菌 體呈單個(偶見成對或呈絲狀)，大小為0. 2 0. 4X 15 μ m。選典型菌落接種含10%犢牛 血清營養瓊脂斜面5支，置37°C，5-10% CO2 (或者燭缸)環境下培養24小時，保存於4°C 冰箱中(不超過7日)作為一級種子。3. 2 二級種子繁殖取一級種子3支，每支用2_3ml營養肉湯洗下，合併接種於350ml含10%犢牛血 清的營養肉湯，置37°C培養24小時，取樣作純粹檢驗合格後，保存於4°C冰箱中(不超過5 日)作為一級種子。3. 3制苗用菌液培養採用培養罐培養，在20L發酵罐中裝入15L的N-J合成培養基及適量消沫劑，滅菌 後按培養基量的2%接種二級種子液300ml，同時按比例加入裂解血球全血150ml，於 37°C培養24小時。3. 4純粹檢驗菌液培養完成後，取樣用10%犢牛血清營養瓊脂平板作純粹檢驗，應純粹。3. 5菌數測定將菌液定量取樣離心後，用生理鹽水連續離心洗滌3次並作適當稀釋，於紫外 分光光度計下測定560nm處OD值，根據公式含菌總數(CFU/ml) = OD560nm值X稀釋倍 數X 2 X 109CFU/ml計算出菌液含菌量，每1. OOml含活菌不低於3. 00 X IO10CFU,計數結果作 為配苗時參考。4 結果取發酵菌液1ml，以3000 5000轉/分鐘離心5_10分鐘後，用生理鹽水連續 離心(3000 5000轉/分鐘，5-10分鐘)洗滌3次；用生理鹽水50ml溶解和稀釋沉澱 (即50倍稀釋)；於紫外分光光度計下測定560nm處OD值(用生理鹽水調0)，測得OD560nm 為0. 589 ；根據公式含菌總數(CFU/ml) = OD560nm值X稀釋倍數X2X 109CFU/ml = 0. 589 X 50 X 2 X 109CFU/ml = 5· 89 X 1010CFU/ml。即每毫升該發酵液中鴨疫裡默氏桿菌的含菌數為589億個。根據該計數結果，發酵液即可用於鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗制苗用的菌液，經滅 活、乳化等最後製成鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗。實施例3實驗室試製生產了 5批共10. 8萬毫升實驗室制疫苗，批號分別為2005001、 2005002、2005003、2005004、2005005。疫苗生產過程中，嚴格按半成品和成品檢驗規定進行 檢驗，半成品生產和檢驗報告結果見表1，成品質量檢驗情況見表2(5批實驗室試製產品成 品的原始檢驗報告詳見後)。表1鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗半成品生產和檢驗結果
權利要求
一種生產鴨疫裡氏桿菌疫苗用菌液的方法，其特徵在於，包括一級種子的繁殖與鑑定、二級種子的繁殖、發酵；所述的一級種子的繁殖與鑑定為將凍幹基礎菌種接入含10％犢牛血清的營養肉湯，37℃培養24小時；然後劃線接種在含10％犢牛血清營養瓊脂平板上，在含5～10％CO2或者燭缸的環境中，經37℃、24～48小時培養後選典型菌落接種含10％犢牛血清營養瓊脂斜面若干支，置37℃，5 10％CO2或者燭缸環境下培養24小時，作為一級種子；所述的二級種子繁殖為取一級種子接種於含10％犢牛血清的營養肉湯，置37℃培養24小時，取樣作純粹檢驗合格後，置2～8℃保存，使用期不得超過5日；所述的發酵，發酵所用的培養基為含1％裂解全血的N J合成培養基；發酵的菌種接種量為按培養基量的2％接種二級種子液；發酵方式為培養罐液體發酵培養；培養條件為37℃連續培養24小時。
2.根據權利要求1所述的生產鴨疫裡氏桿菌疫苗用菌液的方法，其特徵在於，所述 含1 %裂解全血的N-J合成培養基包括基礎培養基和添加物，所述基礎培養基的組分及 比例為胰蛋白腖，1.5-1. 9% ；酵母提取物，0. 2-0.7% ；牛肉浸膏，0. 2-0. 7 % ；水解乳蛋 白，0. 2-0. 7 % ；葡萄糖，0. 1-0.4% ；NaCl,0.5% ；磷酸二氫鉀，0. 1-0. 7 % ；磷酸氫二鉀， 0. 1-0. 7% ；Na2HPO4 · 12Η20，0· 5-0. 9% ； (NH4)2SO4jO. 1-0. 2% ；NH4Cl,0. 01-0. 03% ；其中所述 各組分的百分比為重量/體積百分比；所述添加物為採用頸靜脈採血或頸動脈放血的方法 無菌採取非疫區健壯牛血並無菌脫纖，於-20°C和室溫凍融，反覆凍融3次後，保存於-20°C 備用或採血並無菌脫纖後直接保存於-20°C，使用前取出反覆凍融3次；裂解血球全血按體 積比加入基礎培養基中。
全文摘要
本發明公開了一種生產鴨疫裡氏桿菌疫苗用菌液的方法，包括一級種子的繁殖與鑑定、二級種子的繁殖、發酵；所述的一級種子的繁殖與鑑定為將凍幹基礎菌種接入含10％犢牛血清的營養肉湯，37℃培養24小時；然後劃線接種在含10％犢牛血清營養瓊脂平板上，在含5～10％CO2或者燭缸的環境中，經37℃、24～48小時培養後選典型菌落接種含10％犢牛血清營養瓊脂斜面若干支，置37℃、5-10％CO2或者燭缸環境下培養24小時，作為一級種子；所述的二級種子繁殖為取一級種子接種於含10％犢牛血清的營養肉湯，置37℃培養24小時，取樣作純粹檢驗合格後，置2～8℃保存，使用期不得超過5日；所述的發酵，發酵所用的培養基為含1％裂解全血的N-J合成培養基；發酵的菌種接種量為按培養基量的2％接種二級種子液；發酵方式為培養罐液體發酵培養；培養條件為37℃連續培養24小時。
文檔編號C12R1/01GK101967458SQ201010502308
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月11日 優先權日2010年10月11日
發明者朱德康, 汪銘書, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農業大學實驗動物工程技術中心