一組特異性識別金黃色葡萄球菌腸毒素a的核酸適配體的製作方法
2023-08-01 00:23:26 2
專利名稱：一組特異性識別金黃色葡萄球菌腸毒素a的核酸適配體的製作方法
技術領域：
本發明涉及食品安全生物技術領域，具體是指利用分子生物學和體外化學合成結合的SELEX技術(指數富集的配體系統進化技術)製備一組與金黃色葡萄球菌腸毒素A高特異性高親和力的核酸適配體，為基於核酸適配體識別-金黃色葡萄球菌腸毒素A的新型檢測技術發展提供科學依據和理論基礎。
背景技術：
金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcusaureus Enterotoxins,簡稱 SEs)是一組由金黃色葡萄球菌分泌到細胞外的小分子量(26-30kDa)耐熱性蛋白質毒素。由該腸毒素引起的食物中毒在細菌性食物中毒中佔有相當高的比例，是一個世界性公共衛生問題，其中75%以上是由金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)引起的，其次依次是SED、SEC和SEB。該類腸毒素的中毒症狀主要表現為在攝入2-6小時內出現噁心、嘔吐、腹瀉等不良反應，通常在24小時內症狀減弱。在個別案例中，具有超抗原特性的SEs會引起嚴重的過敏和自身免疫反應，甚至引起毒性-休克綜合症。由於以上這些原因，SEs不僅是食品安全危害，如果將SEs純化後蓄意添加入食物中，還構成了食品安全恐怖。快速、準確、直接的檢測食品中的SEA，進而有效預防和控制食物汙染，一直是食品安全生物技術科學家及有關科研工作者所追求的目標。迄今為止，SEA的檢測方法主要基於免疫反應，涉及應用抗體識別毒素抗原。抗體一般需要通過實驗動物或雜交瘤細胞獲得，製備費時且成本高，而且所得抗體與其他蛋白一樣易受溫度影響，使得檢測方法的發展和實際應用很受限制。核酸適配體是一種相對於抗體特異性更強、穩定性更高、更易於合成和修飾的低成本新型分子識別元件，可通過SELEX 技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,即配體指數富集的系統進化)體外篩選獲得。如能篩選得到SEA特異識別核酸適配體，即可取代以抗體為識別元件的傳統 細菌毒素檢測技術方法，構建以核酸適配體為識別元件的新型高效檢測方法。目前，國內外已有的通過SELEX技術篩選得到蛋白類靶物質核酸適配體相關報導主要包括凝血酶、IgE, HIV-1逆轉錄酶、神經肽Y、蓖麻毒素、肉毒桿菌毒素、前列腺特異抗原、DNA-脫烷烴酶和金黃色葡萄球菌腸毒素B等，未見關於金黃色葡萄球菌腸毒素A核酸適配體序列報導。而SEA抗體難以獲得且製備成本昂貴，使用時受到諸多條件約束，適配體相對於抗體的優勢更為顯著，但其優勢在該方面研究中還未得到利用，因此相關研究工作亟需加強。
發明內容
本發明的目的在於提供一組能與金黃色葡萄球菌腸毒素A特異性結合的核酸適配體序列，並用於開發細菌毒素新型檢測方法，特別涉及基於該組核酸適配體識別、快速檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A的方法，從而克服現有技術中的不足。
為實現上述發明目的，本發明方法利用SELEX技術，以金黃色葡萄球菌腸毒素A為靶標，篩選獲得與靶標高親和性、高特異結合的適配體，通過羧基螢光素(FAM)標記等螢光標記技術實現對食品中的金黃色葡萄球菌腸毒素A的高效檢測。本發明的優點:(I)與抗體相比，核酸適配體更為穩定，可直接大量體外合成、功能化修飾，製備方法簡單、成本低廉，操作更加方便。(2)該組序列是從保守序列顯著、二級結構穩定且與目標毒素具有不同親和力的10條適配體序列中選取出的親和力、特異性均表現優秀的一組核酸適配體序列，能夠特異識別金黃色葡萄球菌腸毒素A。
圖1是Α1、Α15、Α23.2核酸適配體的二級結構2是Α1、Α15、Α23.2核酸適配體的飽和結合曲線3是Α1、Α15、Α23.2核酸適配體的特異性試驗結果
具體實施例方式本案發明人經長期和實踐發現，單鏈核酸鹼基之間存在的相互作用可使其形成很多可能的空間結構，包括發卡、假結、凸環以及G-四鏈體等，這些結構易於與各種靶分子發生構象結合。基於這種構象識別，採用一個足夠容量(IO14-1O15)的核酸文庫能夠包容儘可能的立體結構，因此有可能從中篩選得到任何種類靶物質的高親和力適配體。利用SELEX技術，靶毒素SEA對每輪篩選核酸文庫的指數級進化富集作用，通過數十輪重複篩選，反篩與負篩相結合，最終獲得親和力高且特異性好的核酸適配體序列。根據上述發現，本案發明人提出了一組通過SELEX技術篩選得到與金黃色葡萄球菌腸毒素A特異結合的核酸適配體序列。下面結合說明書附圖和實施例對本發明作進一步的說明，但不限制本發明。競爭SELEX篩選金黃色葡萄球菌腸毒素A的特異性結合核酸適配體，方法大致如下:(I)體外化學合成初始隨機單鏈DNA (ssDNA)文庫及引物序列如下:5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG (40N) CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3 '(由美國Integrated DNA Technologies公司完成);構建了長度為80nt的隨機ssDNA文庫,兩端為固定引物序列，中間為40nt的隨機序列，庫容量為IO14以上；上遊引物:5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3'；下遊引物:5'-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'；5'-磷酸化下遊引物:5' -P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'；將隨機ssDNA文庫、上遊引物和5'-磷酸化下遊引物均用TE緩衝液配製成100 μ M貯存液 於_20°C貯存備用。(2) SELEX 篩選首輪將2nmol隨機單鏈文庫溶於500 μ L結合緩衝液，熱變性約5分鐘，冰浴數分鐘後加入已經結合緩衝液洗滌數次、偶聯了金黃色葡萄球菌腸毒素A的磁納米粒子(即磁珠)，37°C緩慢振蕩，孵育I小時。磁性分離上清，結合緩衝液衝洗磁珠數次，熱解離洗脫，將洗脫液作為模板進行不對稱PCR，上下遊引物濃度比例範圍為10: 1-100: I。PCR結果通過PAGE電泳驗證，出現唯一的80-nt目標條帶並將擴增產物合併作為待切產物，用於單鏈製備。採用Lambda核酸外切酶消化法將待切產物進行酶切反應，滅酶後將酶切產物經尿素變性PAGE電泳驗證，稀釋後的80-nt核酸單鏈文庫作為對照，出現唯一的與對照條帶一致酶切產物即可進行純化。採用飽和酚提純、乙醇沉澱法對製備的核酸單鏈文庫純化，復溶後經NanoDrop2000超微量分光光度計測定ssDNA濃度，定量200pmol投入下一輪篩選。從第四輪開始，每輪先進行負篩，循環反覆，直到第十二輪進行反篩(SEC1等類似物作為反篩靶標)。將第十二輪篩選得到的核酸適配體PCR結果送至上海博尚生物技術有限公司進行克隆測序，獲得40條核酸單鏈序列。採用DNAMAN軟體對核酸單鏈序列進行一級結構分析，獲得40條序列的同源性信息；同時進行同源樹分析，依據序列之間的同源性、保守序列的顯著性將該40條序列分為10個家族。然後用RNA Structured 2軟體對核酸適配體序列的二級結構(如說明書附圖1所示)的穩定性進行分析。結合兩種軟體的分析結果，從每個家族中挑選出一條能級較低、結構穩定、保守序列集中的序列為代表，由上海生工生物技術公司合成5' -FAM螢光標記的核酸適配體序列，以作進一步的親和力、特異性分析。(3) 一組金黃色葡萄球菌腸毒素A核酸適配體的親和力分析將合成的10條FAM螢光標記的金黃色葡萄球菌腸毒素A適配體均用結合緩衝液稀釋成IOOnM貯存液於-20°C貯存備用。將該10條適配體分別進行濃度梯度稀釋，範圍為10-300nM,體積各500 μ L。取等量偶聯金黃色葡萄球菌腸毒素A的磁珠懸浮液經結合緩衝液衝洗，將熱變性後冰浴處理過的適配體梯度溶液與磁珠37°C孵育I小時，磁性分離後用結合緩衝液洗滌數次，熱解離洗脫兩次，將洗脫液合併後用Hitachi F-7000螢光光譜儀測定螢光強度。每個數據做三個平行樣，整個過程注意避光操作。將測得的突光強度值利用GraphPad Prism5軟體計算各適配體的解離常數Kd值，如下表所示，並繪製其飽和結合曲線，如說明書附圖2所示。
權利要求
1.一組特異性識別金黃色葡萄球菌腸毒素A的核酸適配體，其核苷酸序列為: 1)序列表1、2、3所示的核苷酸序列； 2)序列表中序列1、2、3所示核苷酸序列經替換、缺失和/或者插入一個或幾個核苷酸形成的具有等同功能的序列； 3)含有序列表中序列1、2、3所示核苷酸序列為核心序列並兩邊或任一單邊延長的序列。
2.權利要求1所述的金黃色葡萄球菌腸毒素A適配體，其特徵在於其5'-端或3'-端可以進行生物素、FITC、FAM、地高辛等化學修飾，其特徵還在於單獨或聯合使用修飾或不修飾適配體均用於金黃色葡萄球菌腸毒素A的分析檢測。
3.權利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素A核酸適配體在分離富集或分析檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A中的應 用。
全文摘要
本發明公開了一組特異性識別金黃色葡萄球菌腸毒素A的核酸適配體，屬於食品安全生物技術領域。針對現有技術中尚無金黃色葡萄球菌腸毒素A核酸適配體的缺陷，本發明通過SELEX技術12輪的反覆篩選、親和力和特異性試驗的分析驗證，獲得了一組與金黃色葡萄球菌腸毒素A親和性和特異性均良好的核酸適配體。該組核酸適配體為分析檢測食品或環境中的金黃色葡萄球菌腸毒素A提供了一種特異高效的識別配體，為開發替代現有依賴抗體檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A的方法提供了新的選擇。
文檔編號C12N15/115GK103224936SQ201310178878
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月16日 優先權日2013年5月16日
發明者王周平, 黃玉坤, 夏雨, 陳秀娟 申請人:江南大學