一種將L‑鳥氨酸廢菌渣回用於L‑鳥氨酸發酵生產的方法與流程
2023-08-01 01:20:21 2
本發明屬於生物化工領域，具體涉及一種將l-鳥氨酸廢菌渣回用於l-鳥氨酸發酵生產的方法。
背景技術：
：l-鳥氨酸屬於鹼性胺基酸，主要參與生物體內的尿素循環，用於生物體內瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、多胺的生物合成，具有保肝解毒延緩腫瘤細胞生長的功效,另外l-鳥氨酸還具有促進肌肉生長及抗疲勞的作用，因此，l-鳥氨酸在醫藥、保健領域的應用日益廣泛，具有良好的市場前景。微生物直接發酵法是生產l-鳥氨酸的重要來源，菌種主要為穀氨酸棒桿菌的精氨酸缺陷型菌株，培養基中含有適量的精氨酸才能保證菌體大量繁殖，併合成l-鳥氨酸。專利zl201010286236.8公布了一種發酵製備l-鳥氨酸的方法，以葡萄糖為碳源，l-鳥氨酸產量可達35～45g/l。專利zl201510024099.3公布了一種利用纖維床反應器有氧發酵製備l-鳥氨酸的方法，提高了發酵過程效率。但這些方法均採用較為昂貴的酵母膏或高濃度的玉米漿作為發酵培養基的有機氮源，因此氮源成本較高，而l-鳥氨酸發酵結束後衰老的穀氨酸棒桿菌均被作為固體廢渣處理，一旦處理不慎不但汙染環境還會誘發雜菌或噬菌體大量繁殖，給發酵生產帶來嚴重風險。由此可見開發一種合理利用l-鳥氨酸廢菌渣的方法對於實現l-鳥氨酸的清潔生產至關重要。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是提供一種將l-鳥氨酸廢菌渣回用於l-鳥氨酸發酵生產的方法，以解決現有技術存在的成本過高，風險較大等問題。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下：一種將l-鳥氨酸廢菌渣回用於l-鳥氨酸發酵生產的方法，它包括如下步驟：(1)將l-鳥氨酸廢菌渣洗滌後備用；(2)將步驟(1)中洗滌後的l-鳥氨酸廢菌渣加入硫酸水溶液中進行水解，水解完成後離心，取上清液，即得菌渣水解液；(3)將步驟(2)中所得菌渣水解液作為氮源，配製l-鳥氨酸發酵培養基，並用氨水調節ph至6.8～7.0；調節ph後的培養基經滅菌處理後接入菌種，用於l-鳥氨酸發酵。步驟(1)中，所述的l-鳥氨酸廢菌渣為精氨酸缺陷型穀氨酸棒桿菌發酵生產l-鳥氨酸後收集得到的溼菌渣，固含量為23～25％。其中，所述的精氨酸缺陷型穀氨酸棒桿菌已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為cgmccno.3663。該菌株已經在專利「一種穀氨酸棒桿菌及利用該菌製備l-鳥氨酸及其鹽的方法」(申請號201010286236.8)中公開。步驟(1)中，所述的洗滌是指將l-鳥氨酸廢菌渣與氯化鈉水溶液以1：3的體積比混合後，以8000rpm的轉速離心15～20min，棄去上清液；其中，所述的氯化鈉水溶液的濃度為0.9wt％，洗滌次數為2～3次。步驟(2)中，硫酸水溶液和步驟(1)中洗滌後的l-鳥氨酸廢菌渣的用量比為1ml：2～3g；其中，所述的硫酸水溶液的濃度為4.0～8.0mol/l。步驟(2)中，所述的水解是指在80～90℃下，在100～200rpm的攪拌轉速下，水解18～24h。其中，發酵得到步驟(1)中l-鳥氨酸廢菌渣的菌株與步驟(3)中接種的菌株需要相同，優選均為保藏編號為cgmccno.3663的精氨酸缺陷型穀氨酸棒桿菌。步驟(3)中，所述的l-鳥氨酸發酵培養基的組成為：菌渣水解液，葡萄糖90g/l，k2hpo4·3h2o1.5g/l，mgso4·7h2o3.7g/l，feso4·7h2o20mg/l，mnso4·h2o20mg/l，(nh4)2so440g/l，吐溫800.6g/l，生物素50μg/l，維生素b1100μg/l，ph6.8～7.0；其中，其中，菌渣水解液的加入量使得l-鳥氨酸發酵培養基中精氨酸的含量為200～300mg/l。培養基121℃、15min滅菌。其中葡萄糖單獨進行蒸汽消毒。步驟(3)中，l-鳥氨酸發酵的條件為：接種量為3～5％，發酵溫度為30℃，發酵過程中用氨水控制ph為6.8～7.0，通入無菌空氣發酵，通氣量為0.5～1.5vvm，攪拌速度300～500rpm，發酵至殘留葡萄糖低於1g/l時，終止發酵。其中，在l-鳥氨酸發酵中使用的種子培養基的組成為：葡萄糖25g/l，酵母膏5g/l，(nh4)2so45g/l，k2hpo4·3h2o0.5g/l，kh2po41g/l，mgso4·7h2o2.5g/l，nah2po4·2h2o0.5g/l，caco310g/l，ph7.6～7.8。121℃、15min滅菌。種子液培養條件為：搖瓶裝液量10％，接種量2％，30℃，200rpm震蕩培養10h。有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下優勢：與現有l-鳥氨酸發酵使用酵母膏、玉米漿等有機氮源相比，使用廢菌渣的水解液作為有機氮源，不但可以降低發酵法製備l-鳥氨酸的原料成本，而且避免排放廢菌渣引起的雜菌、噬菌體傳播風險與環境汙染，是一種清潔的生產工藝。具體實施方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例中精氨酸含量的檢測採用坂口試劑法，具體見文獻(發酵液中l-精氨酸的檢測方法[j].食品與藥品,2007,9(1):18-20.)。實施例1參考現有專利「一種穀氨酸棒桿菌及利用該菌製備l-鳥氨酸及其鹽的方法」(申請號201010286236.8)，用精氨酸缺陷型穀氨酸棒桿菌cgmccno.3663發酵製備l-鳥氨酸完畢後，將發酵液至於高速離心機中，以8000rpm的轉速離心20min，取出上清液用於l-鳥氨酸產品的提取，收集的菌渣作為利用原料，溼菌渣的固含量為23～25％。實施例2將離心收集的l-鳥氨酸發酵廢菌渣用生理鹽水洗滌2次，收集的溼菌渣分別使用4～8.0mol/l硫酸溶液，其與溼菌渣固形物的體積質量比為1：2.5，分別進行水解，攪拌轉速為200rpm，水解溫度為90.0℃，水解時間為20h。離心後檢測上清液中的精氨酸含量，見表1。可見當硫酸濃度為6mol/l時，水解液中的精氨酸含量較高，因此優選水解時的硫酸濃度為6mol/l。表1硫酸濃度對菌渣水解效果的影響硫酸濃度(mol/l)45678總氮含量(mg/ml)27.5331.2233.3234.2734.76精氨酸含量(mg/ml)3.374.014.584.233.78實施例3將離心收集的l-鳥氨酸發酵廢菌渣用生理鹽水洗滌3次，收集的溼菌渣使用6.0mol/l硫酸溶液水解，其與溼菌渣固形物的體積質量比為1：2.5，攪拌轉速為150rpm，水解溫度為90℃，水解時間為20h。獲得的水解液中精氨酸含量為4.43mg/ml，按照發酵培養基中精氨酸濃度為200mg/l的標準，將46ml水解液替代酵母膏加入到1l發酵培養基中發酵製備l-鳥氨酸，以含有20g/l酵母膏(其它成分相同)的培養基在相同發酵條件下進行發酵對照，發酵條件為：接種量為3％，發酵溫度30℃，發酵過程中控制ph為6.8，無菌空氣的通氣量為0.5vvm，攪拌速度500rpm，發酵至殘留葡萄糖低於1g/l時，終止發酵。最終以菌渣水解液為有機氮源時，l-鳥氨酸產量為34.3g/l，而對照的l-鳥氨酸產量35.2g/l。實施例4將離心收集的l-鳥氨酸發酵廢菌渣用生理鹽水洗滌2次，收集的溼菌渣使用6.0mol/l硫酸溶液水解，其與溼菌渣固形物的體積質量比為1：2.0，攪拌轉速為150rpm，水解溫度為85℃，水解時間為24h。獲得的水解液中精氨酸含量為4.21mg/ml，按照發酵培養基中精氨酸濃度為250mg/l的標準，將60ml水解液替代酵母膏加入到1l發酵培養基中發酵製備l-鳥氨酸，以含有20g/l酵母膏(其它成分相同)的培養基在相同發酵條件下進行發酵對照，發酵條件為：接種量為4％，發酵溫度30℃，發酵過程中控制ph為6.9，無菌空氣的通氣量為1.0vvm，攪拌速度400rpm，發酵至殘留葡萄糖低於1g/l時，終止發酵。最終以菌渣水解液為有機氮源時，l-鳥氨酸產量為33.2g/l，而對照的l-鳥氨酸產量34.5g/l。實施例5將離心收集的l-鳥氨酸發酵廢菌渣用生理鹽水洗滌2次，收集的溼菌渣使用6.0mol/l硫酸溶液水解，其與溼菌渣固形物的體積質量比為1：3.0，攪拌轉速為150rpm，水解溫度為80℃，水解時間為18h。獲得的水解液中精氨酸含量為4.11mg/ml，按照發酵培養基中精氨酸濃度為300mg/l的標準，將73ml水解液替代酵母膏加入到1l發酵培養基中發酵製備l-鳥氨酸，以含有45g/l酵母膏(其它成分相同)的培養基在相同發酵條件下進行發酵對照，發酵條件為：接種量為5％，發酵溫度30℃，發酵過程中控制ph為7.0，無菌空氣的通氣量為1.5vvm，攪拌速度300rpm，發酵至殘留葡萄糖低於1g/l時，終止發酵。最終以菌渣水解液為有機氮源時，l-鳥氨酸產量為31.7g/l，而對照的l-鳥氨酸產量23.5g/l。當前第1頁12