一種抗骨質疏鬆中藥提取物及活性成分的提取工藝和用途的製作方法

2023-08-05 10:46:41 1

專利名稱：：一種抗骨質疏鬆中藥提取物及活性成分的提取工藝和用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種從天然植物中確切的說是中藥綿萆蘚中獲得的具有抗骨質疏鬆活性的提取物及活性成分的提取工藝及其用於治療骨質疏鬆症的用途。
背景技術：
：骨質疏鬆症(OsteOPorosis簡稱0P)是以骨量減少，骨組織微細結構破壞導致骨脆性增加和骨折危險性增加為特徵的一種系統性、全身性骨骼疾病。也是一種以骨密度低下為主要症狀的一種骨代謝失調的全身性疾病。國際醫學界已將骨質疏鬆症與糖尿病、心血管病等並列為嚴重危害老年人健康的三大疾病。綿萆蘚又名白萆蘚、川萆蘚、棉萆蘚。為植物綿萆蘚的乾燥根莖。綿萆蘚的植物來源為薯蕷科綿萆蘚"/oycorea^c/^A^J.Q.Xi，M.MizunoetW.L.Zhao、福州獸蕷DioscoreafutschauensisUlineexR.Knuth和七裂葉萆蘚"/o"orea"/^eWo^Thunb.。其化學成分包含薯蕷皂苷(dioscin)、纖細薯蕷皂苷(gracillin),另含有原薯蕷皂苷(protodioscin)、原纖細薯蕷皂苷(protograci11in,kikubasaponin)及甲基原纖細薯蕷皂苷。性平、味苦。具有利溼去濁，祛風通痺的功效。用於治療淋病白濁、白帶過多、溼熱瘡毒、腰膝痺痛。我們的研究發現綿萆蘚水提取物經大孔樹脂柱後，90%乙醇洗脫物具有較強的抗骨質疏鬆活性，包括促進成骨細胞增殖，抑制破骨細胞形成的活性，-及較明顯的抑制PTH誘導的小鼠顱骨骨吸收亢進的活性並且可以顯著提高OVX大鼠脛骨近端全骨、松質骨的骨礦含量和骨密度、皮質骨的骨礦含量和厚度，改善骨強度。其中更重要的是90%乙醇部位高劑量組可顯著提高脛骨的抗扭力強度，所以我們把90%乙醇洗脫物作為綿萆蘚的活性提取物。在對90"/。乙醇洗脫物進行化學成分研究過程中，分離得到了28個化合物，其中化合物l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或具有促成骨細胞增值活性或具有抑制破骨細胞形成活性或具有抑制骨吸收活性或具有抑制PTH誘導的小鼠顱骨骨吸收亢進活性(具體數據見藥效實驗結果)，即這些化合物均表現了抗骨質疏鬆的活性。所以我們把這些化合物作為綿萆蘚中具有抗骨質疏鬆活性的活性成分，-其中化合物17是抗骨吸收實驗中的主要皂苷類活性成分，作為90%乙醇部位的主要化學成分，在抑制骨吸收的器官培養模型中顯示了較強的活性而且沒有細胞毒性。除本人的研究外，目前尚沒有他人從綿萆蘚中提取具有抗骨質疏鬆活性的提取物及活性成分的報導，本發明就綿萆蘚中具有抗骨質疏鬆活性的提取物及活性成分的提取工藝提出發明申請。
發明內容本發明的目的是提供中藥綿萆蘚活性提取物及活性成分的提取工藝。綿萆蘚經適當的工藝處理後得到的提取物及單體化合物，具有治療或(和)預防骨質疏鬆症的活性。綿萆蘚其植物來源為下列植物中的一種或多種薯蕷科綿萆蘚"/c^cores5770/7^7.05^J.Q.Xi,M.MizunoetW.L.Zhao、福州著菊encores/W5"由〃e/57sUlineexR.Knuth禾口七裂葉萆蘚"/encoresse/^eyzz/c^Thunb.。本發明的目的是通過以下技術方案實現的l.活性提取物的提取工藝-(l)綿萆蘚根莖粗粉，加水回流提取，濾液蒸乾，將得到的浸膏用熱水溶解，上樣於事先處理好的Diaion101柱，用蒸錮水及30%,90%乙醇洗脫，得到的90%乙醇洗脫物。(2)綿萆蘇根莖粗粉，加水回流提取，濾液減壓濃縮至小體積，先經氯仿萃取後經正丁醇萃取，得到的綿萆蘚綿萆蘚總皂苷。(3)綿萆蘇根莖粗粉，加75%乙醇回流提取，提取液減壓回收乙醇，得到的提取物用少量水分散，氯仿萃取後用正丁醇萃取，得到的綿萆蘚綿萆蘇總皂苷。(4)綿萆蘇根莖粗粉，加75%乙醇回流，提取液減壓回收乙醇後得到的提取物通過非極性大孔吸附樹脂，以50%的含水乙醇洗脫，洗脫物減壓回收溶劑，得到的綿萆蘚總皂苷。-本發明綿萆蘚抗骨質疏鬆活性提取物及活性成分的提取工藝所述活性提取物為綿萆蘇的水及醇的簡單提取物通過吸附樹脂柱後，經水一醇混合溶劑洗脫得到的不同比例洗脫物、綿萆蘇總皂苷及從綿萆蘚中提取得到的可以預防或(和)治療骨質疏鬆症的其它提取物。所述的醇指具有以下通式的飽合一元醇及不飽合一元醇CnH2n+10H或CnH2n—力H(n〈5)。在混合洗脫劑中，醇所佔的百分含量在1%_95%之間。所列的吸附樹脂為苯乙烯類、丙烯酸酯類、丙烯醯胺類或氧化氮類大孔吸附樹脂任何一種；柱層析填料為下列填料中的任何一種矽膠、氧化鋁、聚酞胺、吸附樹脂、葡萄糖凝膠、硅藻土。綿萆蘇總皂苷指來源於綿萆蘚且綿萆蘚皂苷類成分的含量超過50%的提取物。所列的綿萆蘚其它提取物，指含有下列化合物中的任何一種，並用於治療或(和)預防骨質疏鬆症的提取物化合物1:綿萆蘚素A(diospongiisnA);2:綿萆蘚素B(diospongiisnB);3:綿萆蘇素C(diospongiisnC);4:piperitol;5:sesaminone;6:(+)—syringaresinol;7:綿萆蘇苷A(spongipregnolosideA);8:綿萆蘇苷C(spongipregnolosideC);9:綿萆蘚苷D(spongipregnolosideD);10:spongiosidesE;11:黃山藥皂苷(dioscin);12:pregna-5，16-diene-lP-ol-20-one-3-0-[oc-L-rhamnopyranosyl-(1—2)]-[oc-L-rhamnopyranosy卜(1—4)]-p-D-glucopyranoside;13:薯蕷阜苷(dioscin);14:prosapogeninA;15:gracillin;16:hypoglaucinG;17:methylprotodioscin;18:glycosideD;19:daucosterol;20:P-sitosterol;21:(j)-oct-l-ene-3-y1"-L一arabinopyranosyl-(1—6)-々-D-Glucopyranoside。以中藥綿萆蘇及新鮮釆集的綿萆蘚的乾燥塊莖為原料，釆用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法、正相薄層層析法、反相薄層層析法及重結晶法得到的上述21種化合物中任何一種的提取物及綿萆蘚總皂苷。所列的溶劑為不多於10個碳原子的滷代烷、醇、酮、酯、醚或其混合物，其中卣代烷具有以下通式CnH2n+1R、CfUl2或CnH2n—A(n<10;R=C1,Br,I)，醇類溶劑具有以下通式"UH或aUH(n〈10),酮類及醚類溶劑具有以下通式CnH2n0或CnH2n—20(n<10)，酯類溶劑具有以下通式CJU)2或CnH2n-202(n<10)。溶劑洗脫方式包括單一溶劑的正相、反相及梯度洗脫。藥效實驗動物體內實驗表明綿萆蘚提取物及總皂苷無論是在抑制0VX大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量和骨密度、松質骨的骨礦含量和骨密度、皮質骨的骨礦含量和厚度的下降，還是在改善骨強度方面都顯示了較強的活性，並呈良好的量效關係。所以我們認為綿萆蘚水提取物經DIOI大孔樹脂柱後30%~90%洗脫物為綿萆蘚的活性提取物，綿萆蘇總皂苷也為活性物質。2.活性成分的提取工藝90%乙醇洗脫物，經矽膠柱層析，用CHCl廠MeOH梯度洗脫，得到6個流份，將流份2、3、4、5、6分別釆用正相柱層析法、反相柱層析法、正相薄層層析法、反相薄層層析法、重結晶法分離得到的各單體化合物。本發明綿萆蘇活性提取物及活性成分的提取工藝所述的活性成分是指以綿萆蘚活性提取物為原料，釆用正相柱層析色譜法、反相柱層析色譜法，正相製備薄層層析法、反相製備薄層層析法，反覆重結晶法，製備液相色譜蜂分離純化得到的單體化合物包括l:綿萆蘚素A(diospongiisnA);2:ig萆蘚素B(diospongiisnB);3:綿萆蘚素C(diospongiisnC);4:piperitol;5:sesaminone;6:(+)-syringaresinol;7:綿萆蘚脊A(spongipregnolosideA);8:綿萆蘚苷C(spongipregnolosideC);9:綿萆蘚苷D(spongipregnolosideD);10:spongiosidesE;11:黃山藥皂苷(dioscin);12:pregna-5,16-diene-lp-ol_20-one-3-0-[a-L-rhamnopyranosyl-(1—2)]-[a-L-rhamnopyranosy1-(1—4)]-(3-D-glucopyranoside;13:薯蕷阜苷(dioscin);14:prosapogeninA;15:gracillin;16:hypoglaucinG;17:methylprotodioscin;18:glycosideD;19:daucosterol;20:(3-sitosterol;21:(A)-oct-l-ene-3-yl(9~a-L-arabinopyranosyl-(1—6)-P-D-Glucopyranoside。所述的柱層析色譜填料為下列填料中的任何一種矽膠、氧化鋁、聚醯胺、吸附樹脂、葡萄糖凝膠、0DS、硅藻土；製備薄層板的吸附劑為矽膠G、矽膠H、矽膠GF254、氧化鋁及聚醯胺中的任何一種。所列的溶劑為下列溶劑及與水以任意比例混合的溶劑不多於10個碳原子的卣代烷、醇、酮、酯、醚或其混合物等，其中卣代烷具有以下通式CnH2n+1R、CJUl2或CJk-^(n<10;R=C1,Br，I),醇類溶劑具有以下通式CnH2n+力H或CnH2n—!OH(n<10),酮類及醚類溶劑具有以下通式CnH2n0或CnH2n_20(n<10),酯類溶劑具有以下通式UU)2或CnH2n-202(n<10)。溶劑洗脫方式包括單一溶劑的正相、反相及梯度洗脫。在對90%乙醇洗脫物進行化學成分研究過程中，分離得到了28個化合物，對它們同時進行促成骨樣細胞增殖、抑制破骨樣細胞形成實驗及抑制PTH誘導骨吸收的實驗。在實驗中，化合物l、6、7、9、11、14、15及16顯示了很強的促成骨細胞增殖活性，化合物8、12、13、17、18、20及21具有較弱的活性。在抑制破骨樣細胞形成實驗中，有效的化合物有2、3、4、6、13、17、19及20。抑制骨吸收實驗中有效的化合物有2、3、4、5、6、10、16、17及21。其中化合物2、3、4、5、6、16、17及21具有抑制PTH誘導的小鼠顱骨骨吸收亢進活性，即這21個化合物均表現了抗骨質疏鬆的活性。所以我們把這些化合物作為綿萆蘇中的活性成分，其中化合物17是抗骨吸收實驗中的主要活性成分，在小鼠0VX模型中，化合物17抑制了全骨骨礦含量、骨密度和全骨斷面面積的降低，松質骨骨密度的降低，皮質骨的內、外膜周長的增長，皮質骨骨礦含量、皮質骨厚度和皮質骨密度的下降及抗扭力的減弱。具有較強的抗骨質疏鬆作用而且不具有細胞毒性。本發明的有益效果是U)、本發明提供了從天然植物綿萆蘇中提取抗骨質疏鬆活性較強的提取物的提取工藝，此工藝簡單，操作方便，生產成本較低。(2)、本發明提供了綿萆蘚中具有抗骨質疏鬆活性的活性成分的提取工藝，並且找到了含量大、活性強且基本沒有毒性的化合物。(3)、這些工藝製備的提取物及化合物可以為製備預防或(和)治療骨質疏鬆症的藥物提供優質原料產品。圖1為綿萆蘚活性成分提取工藝圖圖2為本發明中提取的化合物1圖3為本發明中提取的化合物2圖4為本發明中提取的化合物3圖5為本發明中提取的化合物4圖6為本發明中提取的化合物5圖7為本發明中提取的化合物6圖8為本發明中提取的化合物7圖9為本發明中提取的化合物8圖IO為本發明中提取的化合物9圖11為本發明中提取的化合物10圖12為本發明中提取的化合物11圖13為本發明中提取的化合物12圖14為本發明中提取的化合物13.一圖15為本發明中提取的化合物14圖16為本發明中提取的化合物15圖17為本發明中提取的化合物16圖18為本發明中提取的化合物17圖19為本發明中提取的化合物18圖20為本發明中提取的化合物19—圖21為本發明中提取的化合物20圖22為本發明中提取的化合物21具體實施例方式1具有抗骨質疏鬆活性提取物的提取工藝實例1:水提取物經大孔樹脂柱後，90%乙醇洗脫物的製備方法綿萆蘚W)克，粉碎成100-200目左右的粗粉，加100ml水回流提取二次，每次1小時，所得溶劑經凍幹或減壓乾燥，得到提取物3.6g,此提取物溶於熱水後通過大孔吸附樹脂柱，用水一醇混合溶劑洗脫得到的含30-90%醇洗脫物。實例2:綿萆蘚總皂苷的製備方法的①綿萆蘚根莖100克，粉碎成100~200目左右的粗粉，加600ml水回流提取2次，每次2小時，減壓濃縮提取物至小體積，先經氯仿萃取除去脂溶性成分，後經正丁醇萃取，得綿萆蘇總皂苷26.9克。②綿萆蘇根莖100克，粉碎成100-200目左右的粗粉，加600亳升75%乙醇回流提取2次，每次2小時，濾液經減壓回收乙醇後得到的提取物用少量水分散，先經氯仿萃取除去脂溶性成分，後經正丁醇萃取，得綿萆蘚總皂苷36.9克。③綿萆蘇根莖100克，粉碎成100;200目左右的粗粉，加600亳升75%乙醇回流提取2次，每次2小時，濾液減壓回收乙醇後得到提取物。將提取物通過非極性大孔吸附樹脂柱，以50%的含水乙醇洗脫，洗脫物經減壓回收溶劑，得綿萆蘇總皂苷16.2克。2綿萆蘚提取物的體內實驗實驗方法將90隻6月齡的健康未交配Wister大鼠，經適應性餵養l廚後，進行雙卵巢切除術或假手術，隨機分成9組U)卵巢切除10周組(control組)卵巢切除術後10周處死。(2)假手術組(sham組)進行手術，但不摘除卵巢，IO周后處死。(3)陽性對照組(positivecontrol組)卵巢切除術兩周後經皮下注射給藥0.1亳克/千克/天17--estradiol(購於日本東京化成工業株式會社)，用藥8周後處死。(4)萆蘚9德乙醇部位高劑量組(90y。EtOH100):卵巢切除術兩周後經胃腸道給藥，灌注萆蘚90%乙醇部位100亳克/千克/天，用藥8周後處死。(5)萆蘚提取物低劑量組(9(T/。Et0H50):卵巢切除術兩周後經胃腸道給藥，灌注萆蘇90%乙醇部位50毫克/千克/天，用藥8周後處死。(6)萆蘇總皂苷高劑量組(T.saponin100):卵巢切除術後8周經胃腸道給藥，灌注萆蘚總皂苷100毫克/千克/天，用藥8周後處死。(7)萆蘇總皂苷低劑量組(T.saponin50):卵巢切除術兩周後經胃腸道給藥，灌注萆蘇總皂苷50亳克/千克/天，用藥8周後處死。所有動物處死前，麻醉狀態下用外周肢體定量計算機斷層掃描(PQCT)測量大鼠左側脛骨近端幹髓端生長板下1-5mm範圍內的松質骨、皮質骨和全骨，掃描4個斷面，數據取自3-4mm處斷面。測量指標全骨礦量、全骨密度、全骨斷面積、松質骨礦量、松質骨密度、皮質骨外周周長、內周周長、皮質骨礦量、皮質骨密度、皮質骨厚度、抗壓力、抗折力、抗扭力等。實驗結果(1)各實驗組對大鼠脛骨近端全骨的影響實驗組全骨礦量全骨密度全骨斷面積假手術組陽性對照組90。細H10090%EtOH對照組8.13±0.75#9.77±1.348.94±1.12'9.17±0.86'8.45±709.39±31695.36±50.40*655.01±35.05760.25±20.29#638.32±12.77±1.3812.85±1.7112.58±1.2013.26±1.7112.93±500.5639.150.95總皂苷98.66±636.37±13.60±1000.3815.790.55總皂苷50108.57±0.85656.32±44.1713.01±1.52#戶<0.Ol與偽手術組對照，*屍<0.Ol與對照組對照(2)各實驗組對大鼠脛骨近端松質骨影響實驗組松質骨礦量松質骨密度對照組0.79±0.16150.9±27.4#假手術組0.87±0.08208.6±56.9陽性對照組0.79±0.13198.3±51.3*'90%EtOH1000.97±0.33*227.0±33.2…90穀OH500.99±0.18"193.9±30.l…總皂苷ioo1.02±0.09**202.0±6.9"'總皂苷500.97±0.24*197.2±30.7…#p<0.05.與偽手術組對照，*p<0.05,"p<0.01，"'p<0.001與對照組對照(3)各實驗組對大鼠脛骨近端皮質骨的影響A.各實驗組對大鼠脛骨近端皮質骨的內、外膜周長的影響實驗組外膜周長內膜周長對照組12.65±0.689.59±0.70#假手術組12.68±0.848.92±0.80陽性對照組12.56±0.599.14±0.46*90%EtOH10012.88±0.859.62±0.9890%EtOH5012.69±0.459.64±0.56總阜苷ioo13.07±0.279.96±0.32總皂苷5012.81±0.749.74±0.75B.#p<0.05與偽手術組對照，*p<0.05與對照組對照各實驗組對大鼠脛骨近端皮質骨的骨礦含量、骨密度及皮質骨厚度的影響實驗組皮質骨骨礦含皮質骨骨密度皮質骨厚度對照組5.34±0.41#'假手術組6.09±0.241251.58±13.821257.85±0.49±0.03##0.60±0.02陽性對照組90%EtOH10090%EtOH50總皂苷IOO總皂苷506.86±0.67*6.62±0.44*6.32±0.34'6.25±0.21*6.28±0.51*10.i31291.97±15.761294.43±18.931268.60±15.701254.27±12.861258.30±9.840.54±0.04**0.52±0.03*0.49±0.030.50±0.020.49±0.03p<0.Ol與偽手術組對照，p<0.05，''p<0.Ol與對照組對照(4)各實驗組對大鼠脛骨近端骨強度的影響實驗組X軸抗壓力Y軸抗折力極軸抗扭力對照組假手術組陽性對照組90%EtOH10090%EtOH50總阜苷100總皂芳AO'3.51±0.514.87±0.864.15±0.94*3,85±0.574.47±0.664.44±0.974.26±0.574.87±0.687.17±1.25#8.71±1.697.87±1.278.06±1,35*p<0.05,##p<:0.01.與偽手術組對照；*p<0.05,''p<0.Ol與對照組對照結論:上述數據以綿萆蘚水及醇的簡單提取物通過大孔吸附樹脂柱經含-30-90%的水一醇混合溶劑洗脫物及綿萆蘇總皂苷為例，證實綿萆蘇水及醇的簡單提取物經含30-90%的水一醇洗脫物及綿草薛總皂苷無論是在提提高OVX大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量和骨密度、松質骨的骨礦含量和骨密度、皮質骨的骨礦含量和厚度，還是在改善骨強度方面，都顯示了較強的活性。並且含30-90%不同濃度的水一醇洗脫物組中存"在可顯著提高脛骨的抗扭力強度的組分,這是許多抗骨質疏鬆藥物所達不到的。3具有抗骨質疏鬆活性的化合物的提取工藝實例如圖1將80克90°/。乙醇部位，經矽膠柱層析，用CHC13-MeOH梯度洗脫,1-1:99),得到6個流份(Fnl-Fr.6),流份2、3、4、5、6經反覆矽12575731±+|+|338483777541358+1±+145o544339+|±±675767膠柱層析、反相薄層製備、大孔樹脂柱層析、重結晶等方法得到28個化合物，其中的21個經實驗證實具有抗骨質疏鬆活性，分別為l:綿萆蘇素A(cUospongiisnA);2:綿萆蘇素B(diospongiisnB);3:綿萆蘚素C(diospongiisnC);4:piperito1;5:sesaminone;6:(+)-syringaresinol;7:綿萆蘚苷A(spongipregnolosideA);8:綿萆解'苷C(spongipregnolosideC);9:綿萆蘚苷D(spongipregnolosideD);10:spongiosidesE;11:黃山藥皂苦(dioscin);12:pregna-5，16-diene-1P-ol-20-one-3-0—[oc-L-rhamnopyranosy1-(1—2)]-[a~L-rhamnopyranosyl-(1—4)]-|3-D-glucopyranoside;13:薯蕷皂苷(dioscin);14:prosapogeninA;15:gracillin;16:hypoglaucinG;17:methylprotodioscin;18:glycosideD;19:daucosterol;20:P-sitosterol;21:(_/)-oct-1-ene-3-yla-L-arabinopyranosyl-(1—6)-(3-D-Glucopyranoside。並運用核磁共振(麗R),質譜(MS),紅外(IR),氣相(GC)等光譜、色譜手段，確定T它們的結構、相對及絕對構型。(各化合物的結構見附圖2—22)4.化合物活性篩選(1)促成骨樣細胞增值實驗實驗數據見下表所有化合物促成骨細胞增值實驗數據tableseeoriginaldocumentpage14結論化合物l、6、7、9、11、14、15及16均顯示了很強的促成骨樣細胞增值的活性。化合物8、12、13、17、18、20及21的活性較弱。(2)抑破骨細胞形成實驗實驗數據見下表.二芳基庚酮類及部分齒體皂苷類抑制破骨細胞形成的實驗數據tableseeoriginaldocumentpage15結論上述數據表明除化合物1以外，所有的二芳基庚酮類及甾體皂苷類化合物均具有潛在的抑制破骨細胞形成的活性。其中化合物2、3、4及6在200//M時，完全抑制了破骨細胞的形成。甾體皂苷13、17、19及20也顯示了較強活性。(3)抑制骨吸收實驗實驗數據見下表所有化合物抑制骨吸收的實驗數據tableseeoriginaldocumentpage1617.1±20.7±10^f30.9±4.521^^23.8±1.64.5*1.l求結論二芳基庚酮類化合物2、3、4及6在低濃度下(20nM)就顯示了強的抑制骨吸收的活性。化合物5在較高濃度下(200nM)具有此活性。甾體皂苷類化合物IO、16、17及21在較高濃度下同樣具有抑制骨吸收的活性。(4)對PTH誘導的骨吸收的抑制實驗實驗數據見下表所有化合物對由PTH誘導的45Ca釋放的抑制作用Comp,45Carelease(%)4520020Comp.Carelease(%)20020137911131517192144.6±21.8±3.31.919.1±18.2±1.6*3.2*15.1±14.7±1.5**0.8**22.2±27.4±0.24.231.1±25.0±1.64.537.3±21.6±9.51.026.2±32.6±1.21.744.6±41.9±5.18.617.4±24.9±1.61.232.5±28.4±0.59.120.7±23.8±1.r1.624681012141618PTHControlElcitonin30.5±0.413.6±23.3±1.920.7±4.037.3±4.129.6±1.923.7±1.017.1±4.5*30.2±3.818.2±3.1*22.6±2.520.9±0.4*23.8±7.041.9±3.525.3±7.527.7±2.030.9±4.525.7±3.925.3±2.6#15.4±1.318.4±0.7'結論二芳基庚酮類及木脂素類化合物的量雖然少，但是卻具有極強的抑制骨吸收的活性，包括化合物2、3、4、5及6。甾體皂苷類化合物16、17及21也具有較強的抑制活性。其中化合物17佔甾體皂苷總量的1/2左右，所以對化合物17進行了動物體內實驗的研究。5.主要活性成分化合物17的抗骨質疏鬆活性動物體內實驗實驗方法將50隻ddy未交配雌性小鼠，經適應性餵養l周后，進行雙卵巢切除術或假手術，隨機分成5組(1)卵巢切除7周組(control組)卵巢切除術後7周處死。(2)假手術組(sham組)進行手術，但不摘出卵巢，7周後處死。(3)陽性對照組(positivecontrol組)卵巢切除術兩周後經皮下注射給藥0.1亳克/千克/天17/-estradiol,用藥5周後處死。(4)化合物17高劑量組(M-protod-50):卵巢切除術2周後經胃腸道給藥灌注化合物1750毫克/千克/天，用藥5周後處死。(5)化合物17低劑量組(M-protod-20):卵巢切除術2周後經胃腸道給藥灌注化合物1720亳克/千克/天，用藥5周後處死。所有動物處死前，麻醉狀態下用外周肢體定量計算機斷層掃描(PQCT)測量左側脛骨近端幹骺端生長板下及股骨遠端l-5亳米範圍內的松質骨、皮質骨和全骨，掃描4個斷面，數據取自1-2亳米處斷面。測量指標全骨礦量(TOT-CNT，mg/mm)、全骨密度、全骨斷面積、松質骨礦量、松質骨密度、皮質骨外膜周長、內膜周長、皮質骨礦量、皮質骨密度、皮質骨厚、抗壓力、抗折力、抗扭力等。實驗結果(1)各實驗組對小鼠脛骨近端全骨的影響tableseeoriginaldocumentpage18(2')各實驗組對小鼠脛骨近端松質骨的影響組另U松質骨的骨礦含量松質骨骨密度tableseeoriginaldocumentpage19B.各實驗組對小鼠脛骨近端皮質骨的骨礦含量、骨密度及皮質骨厚度的影響__組別皮質骨骨礦含量皮質骨骨密度皮質骨厚度.對照組0.84±0.25##873.18±25.98#0.13±0.03"假手術組1.28±0.23948.93±82.000.23±0.05陽性對照組1.24±0.09''942.25±16.79…0.21±0.or*M-protod-200.85±0.26877.76±45.250.15±0.04M—protod-501.14±0.03931.51±32.69**0.19±0.04'*P<0.Ol與偽手術組對照，*p<0.05，"p<0.Ol與對照組對照。19(4)各實驗組對小鼠脛骨近端骨強度的影響組別X軸抗壓力Y軸抗折力對照組假手術組陽性對照組M-protod-20M-protod-50極軸抗扭力0.40±0.06#0.58±0.180.47±0.05*0.41±0.050.46±0.090.40±0.05#0.59±0.190.49±0.05'0.44±0.070.46±0.080.73±0.09#1.09±0.350.91±0.07"0.77±0.130.89±0.16**p<0.05與偽手術組對照；'P<0.05，''p6)-|3-D-Glucopyranoside，上述單體化合物用於製備治療抗骨質疏鬆症的藥物。4.根據權利要求2所述的綿萆蘚活性提取物，其特徵在於所述的醇具有以下通式CJl2屮0H或CJk—力H(n〈5);在混合洗脫劑中，醇所佔的百分含量在1%-95%之間。5.根據權利要求2所述的綿萆蘇活性提取物的提取工藝，其特徵在於所述的吸附樹脂為苯乙烯類、苯丙酸類、丙稀醯胺類及氧化氮類大孔樹脂中的任何一種，所述的綿萆蘚總皂苷指來源於綿萆蘚的提取物，在提取物中綿萆蘚皂苷類成分的含量超過50%。6.—種如權利要求1所述的綿萆蘚抗骨質疏鬆活性提取物的提取工藝，其特徵在於以中藥綿萆蘇及新鮮釆集的綿萆蘚的乾燥根莖為原料,釆用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法得到的權利要求2所述的各種提取物。7.根據權利要求5所述的中藥綿萆蘚抗骨質疏鬆活性提取物的提取工藝，其特徵在於所列的溶劑為不多於10個碳原子的滷代烷、醇、酮、酯、醚及其混合物，其中卣代烷具有以下通式CnH2n+1R、CJUl2或CJk—A(n<10;R=C1,Br,I),醇類溶劑具有以下通式CnH2n+1OH或CJk-力H(n<10)，酮類及醚類溶劑具有以下通式CJU)或CnH2n_20(n<10),酯類溶劑具有以下通式CJk02或CnH2n—202(n<10),溶劑洗脫方式包括單一溶劑的正相、反相及梯度洗脫。8.根據權利要求7所述的中藥綿萆蘚抗骨質疏鬆活性提取物的提取工藝，其特徵在於綿萆蘚抗骨質疏鬆活性成分是以中藥綿萆蘇及新鮮釆集的綿萆蘚的乾燥根莖為原料，釆用正相柱層析色譜法、反相柱層析色譜法，正相製備薄層層析法、反相製備薄層層析法，反覆重結晶法，反相製備液相色譜法分離純化得到的單體化合物。9.根據權利要求8所述的綿萆蘚抗骨質疏鬆活性成分的提取工藝，其特徵在於綿萆蘚活性成分在柱層析過程中用到的柱色譜填料為矽膠、氧化鋁、聚醯胺、吸附樹脂、葡萄糖凝膠、0DS及硅藻土；製備薄層板的吸附劑為矽膠G、矽膠H、矽膠GF254、氧化鋁、聚醯胺及0DS。10.根據權利要求9所述的綿萆蘚活性成分的提取工藝，其特徵在於綿萆蘚活性成分在柱層析、薄層層析、重結晶及製備液相過程中用到的溶劑為權利要求7中所述的溶劑及其與水任何比例的混合溶劑，溶劑洗脫方式包括單一溶劑的正相、反相及梯度洗脫。全文摘要本發明公開了中藥綿萆薢抗骨質疏鬆活性提取物與活性成分的提取工藝及其用於治療骨質疏鬆症的用途。該工藝以中藥綿萆薢及新鮮採集的綿萆薢的乾燥塊莖為原料，採用溶劑提取法、樹脂吸附法、正相柱層析法及反相柱層析法製備的提取物。並且以中藥綿萆薢活性提取物為原料，應用正相柱層析色譜法、反相柱層析色譜法，正相製備薄層層析法、反相製備薄層層析法，重結晶法及製備液相色譜法分離得到各單體化合物。該工藝得到的綿萆薢的提取物及部分單體化合物用於製備抗骨質疏鬆症的藥物。文檔編號A61K36/8945GK101181469SQ20071015849公開日2008年5月21日申請日期2007年11月26日優先權日2007年11月26日發明者陽劉,劉志惠,軍殷,勇王,卓王申請人:瀋陽藥科大學