納米氧化銅模擬鹼性過氧化物酶的製作方法

2023-08-06 03:40:41 1

本發明涉及以納米氧化銅作為模擬鹼性過氧化物酶，在鹼性條件下催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸，形成穩定的二聚體螢光產物，測定過氧化氫的螢光分析方法，屬於分析化學和納米技術領域。

背景技術：

天然酶作為生物催化劑，因其催化效率高、專一性強。反應條件溫和而受到廣泛的關注和應用，與生物體的生長、發育、繁殖等生命活動有著密切的聯繫。但由於天然酶的製備和純化成本高、操作繁瑣，價格昂貴，並且容易受到各種物理、化學因素的影響而失去活性，使其實際應用受到極大限制。納米人工模擬酶相較於天然酶在高溫、極端pH、高鹽濃度等惡劣環境下依然能保持良好的催化活性，並且具有結構穩定、經濟、易於大規模製備以及可調催化活性等優點，使納米人工模擬酶成為生物醫學應用中的有前景的工具。

過氧化物酶是由微生物或植物所產生的一類氧化還原酶，在許多生物系統中起關鍵作用，並且是生物分析和臨床化學中的重要工具。過氧化氫是生化反應中重要的中間產物，所以對過氧化氫及其相關物質的精確測定具有重要意義。天然過氧化物酶及其模擬物通常在酸性或中性條件下發揮最佳性能。然而，在鹼性條件下進行的研究很少。因此，鹼性過氧化物酶模擬物的發現對於實際應用具有重要意義。

本發明基於納米氧化銅作為模擬鹼性過氧化物酶，在鹼性條件下催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸產生二聚體螢光產物，提供一種以納米氧化銅為催化劑測定過氧化氫的螢光分析方法。

技術實現要素：

本發明的目的是基於納米氧化銅作為模擬鹼性過氧化物酶，在鹼性條件下催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸產生二聚體螢光產物，提供一種以納米氧化銅為催化劑測定過氧化氫的螢光分析方法。

為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案：所述一種納米氧化銅模擬鹼性過氧化物酶，其特徵是納米氧化銅在鹼性條件下催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸作為模擬鹼性過氧化物酶；所述的納米氧化銅由如下步驟製得：1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完後繼續攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉澱；3）將反應得到的黑色氧化銅沉澱離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓乾燥，即得納米氧化銅粉體。

所述的一種納米氧化銅模擬鹼性過氧化物酶，其特徵是將對羥基苯丙酸、過氧化氫、納米氧化銅溶液和磷酸鹽緩衝液四者混合溫浴反應，反應產物具有螢光，最大激發波長和發射波長分別為320 nm和409 nm。

納米氧化銅模擬鹼性過氧化物酶最佳活性pH值為10.1~10.3。

納米氧化銅對底物對羥基苯丙酸的米氏常數為0.68 mmol/L，對底物過氧化氫的米氏常數為5.4 mmol/L。

本發明基於納米氧化銅模擬鹼性過氧化物酶測定過氧化氫的螢光分析方法，其特徵是將對羥基苯丙酸、過氧化氫、納米氧化銅溶液和磷酸鹽緩衝液四者混合溫浴反應，測定螢光強度。

上述的納米氧化銅由如下步驟製得：1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完後繼續攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉澱；3）將反應得到的黑色氧化銅沉澱離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓乾燥，即得納米氧化銅粉體。

所述的一種基於納米氧化銅模擬鹼性過氧化物酶測定過氧化氫的螢光分析方法，其特徵是將50 µL不同濃度的過氧化氫溶液，50 µL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸，200 µL濃度為2mg/L的納米氧化銅溶液加入到700 µL濃度為100mmol/L、pH為10.25的磷酸鹽緩衝溶液中，混合液在65 ℃溫浴，45分鐘後分別測定其在409 nm處的螢光強度，激發波長為320 nm，以螢光強度對過氧化氫濃度作圖得到標準曲線。

螢光強度與過氧化氫濃度在0.05~0.4 mmol/L範圍內呈線性關係，檢測限為0.81 µmol/L。

所述的螢光反應體系的pH值優選為10.25，氧化銅濃度優選為0.4mg/L，對羥基苯丙酸濃度優選為4mmol/L。

所述的螢光反應溫度優選為65℃，反應時間優選為45分鐘。

本發明的技術方案具體步驟如下：

（一）納米氧化銅的製備：

取醋酸銅溶液和冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰，快速加入氫氧化鈉溶液，加完後，繼續攪拌後，得到黑色氧化銅。將反應得到的黑色氧化銅立即離心，用無水乙醇洗滌，減壓乾燥，即得納米氧化銅粉體。將納米氧化銅粉體分散於二次蒸餾水中得到棕色納米氧化銅膠體溶液。

納米氧化銅具體製備步驟如下：

（1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；

（2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完後繼續攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉澱；

（3）將反應得到的黑色氧化銅沉澱離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓乾燥，即得納米氧化銅粉體。

（二）過氧化氫的測定

在EP管中依次加入過氧化氫溶液、對羥基苯丙酸、納米氧化銅、磷酸鹽緩衝液，將混合液放入65 ℃水浴。45分鐘後測定其螢光強度，以螢光強度對過氧化氫濃度作圖得到標準曲線以用於測定過氧化氫。

本發明的優點：

本發明納米氧化銅模擬鹼性過氧化物酶，在鹼性條件下催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸產生二聚體螢光產物，納米氧化銅對底物對羥基苯丙酸的親和力高於辣根過氧化物酶。本發明納米氧化銅模擬鹼性過氧化物酶可用於過氧化氫的螢光分析，測定過氧化氫的線性範圍為0.05~0.4 mmol/L，其檢測限為0.81 µmol/L，具有靈敏度高，樣品需求量少，重現性好，成本低等優點。。

附圖說明

圖1為反應體系的螢光光譜圖。

圖2為pH值對螢光強度的影響圖。

圖3為反應溫度對螢光強度的影響圖。

圖4為反應時間對螢光強度的影響圖。

圖5為納米氧化銅濃度對螢光強度的影響圖。

圖6為對羥基苯丙酸濃度對螢光強度的影響圖。

圖7為納米氧化銅對於對羥基苯丙酸的穩態動力學曲線圖。

圖8為納米氧化銅對於過氧化氫的穩態動力學曲線圖。

圖9為過氧化氫的標準曲線圖。

具體實施方式

以下通過實施例對本發明做進一步說明，但是本發明不僅限於此。

實例1：

納米氧化銅具體製備步驟如下：（1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；（2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完後繼續攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉澱；（3）將反應得到的黑色氧化銅沉澱離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓乾燥，即得直徑為6 nm的納米氧化銅粉體。

實例2：

將50 µL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 µL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 µL濃度為2mg/L的實例1製備的納米氧化銅溶液加入到700 µL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩衝溶液（pH 10.25）中，混合搖勻後置於65℃溫浴，45分鐘後測定其螢光光譜。如圖1所示，螢光產物激發波長為320 nm，發射波長為409 nm。

實例3：

將50 µL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 µL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 µL濃度為2mg/L的實例1製備的納米氧化銅溶液加入到700 µL濃度為100mmol/L不同pH的磷酸鹽緩衝溶液（pH 9～11）中，混合搖勻後置於65℃溫浴，45分鐘後測定其在409 nm處的螢光強度（激發波長為320 nm）。如圖2所示，螢光強度在pH為10.1~10.3之間達到最大值。

實例4：

將50 µL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 µL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 µL濃度為2mg/L的實例1製備的納米氧化銅溶液加入到700 µL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩衝溶液（pH 10.25）中，混合搖勻後置於不同溫度水浴（25℃～85℃）溫浴，45分鐘後測定其在409 nm處的螢光強度（激發波長為320 nm）。如圖3所示，螢光強度在65℃時達到最大值。

實例5：

將50 µL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 µL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 µL濃度為2mg/L的實例1製備的納米氧化銅溶液加入到700 µL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩衝溶液（pH 10.25）中，混合搖勻後置於65℃溫浴，反應不同時間（0~75分鐘）後測定其在409 nm處的螢光強度（激發波長為320 nm）。如圖4所示，螢光強度在45分鐘時達到最大值。

實例6：

將50 µL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 µL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 µL不同濃度的實例1製備的納米氧化銅溶液（0～5 mg/L）加入到700 µL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩衝溶液（pH 10.25）中，混合搖勻後置於65℃溫浴，45分鐘後測定其在409 nm處的螢光強度（激發波長為320 nm）。如圖5所示，螢光強度隨混合液中納米氧化銅濃度增大而增大並在終濃度為0.4 mg/L時達到最大。

實例7：

將50 µL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 µL不同濃度的對羥基苯丙酸（0～80 mmol/L）和200 µL濃度為2mg/L的實例1製備的納米氧化銅溶液加入到700 µL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩衝溶液（pH 10.25）中，混合搖勻後置於65℃溫浴，45分鐘後測定其在409 nm處的螢光強度（激發波長為320 nm）。如圖6所示，螢光強度隨混合液中對羥基苯丙酸濃度增大而增大，在終濃度為3.5 mmol/L時，螢光強度達到最大值。

實例8：

將50 µL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 µL不同濃度的對羥基苯丙酸（0～60 mmol/L）和200 µL濃度為2 mg/L的實例1製備的納米氧化銅溶液加入到700 µL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩衝溶液（pH 10.25）中，混合搖勻後置於37℃溫浴，1分鐘後測定其在409 nm處的螢光強度（激發波長為320 nm），計算初速度。通過米氏方程擬合，可以得出納米氧化銅對底物對羥基苯丙酸的米氏常數為0.68 mmol/L（見圖7）。

實例9：

將50 µL不同濃度的過氧化氫溶液（1～120 mmol/L），50 µL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 µL濃度為2mg/L的實例1製備的納米氧化銅溶液加入到700 µL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩衝溶液（pH 10.25）中，混合搖勻後置於37℃溫浴，1分鐘後測定其在409 nm處的螢光強度（激發波長為320 nm），計算初速度。通過米氏方程擬合，可以得出納米氧化銅對底物過氧化氫的米氏常數為5.4 mmol/L（見圖8）。

實例10：

將50 µL不同濃度的過氧化氫溶液（0～8 mmol/L），50 µL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 µL濃度為2mg/L的實例1製備的納米氧化銅溶液加入到700 µL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩衝溶液（pH 10.25）中，混合搖勻後置於65℃溫浴，45分鐘後測定其在409 nm處的螢光強度（激發波長為320 nm），以螢光強度對過氧化氫濃度作圖得到標準曲線。如圖9所示，螢光強度與過氧化氫濃度在0.05~0.4 mmol/L範圍內呈線性關係，檢測限為0.81 µmol/L。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改，等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。