羊魏氏梭菌pcr檢測試劑盒的製作方法

2023-07-28 00:10:01

專利名稱：羊魏氏梭菌pcr檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，尤其是一種羊魏氏梭菌PCR檢測試劑盒。
背景技術：
魏氏梭菌，又稱產氣莢膜梭菌ipiostridium prerfringens)屬於腐生性厭氧芽胞致病菌，是引起畜禽猝死症、壞死性腸炎、腸毒血症、氣性壞疽的主要致病菌(W Muller, 1998)。該菌分A、B、C、D、E 5個不同的菌型(Laetitia Petit等，1999)致病性主要與其形成的毒素有關，產生的毒素共有12種，α毒素是由其共同產生的一種壞死、致死性毒素，有人認為其是家畜「猝死症」的主要致病因(Rood JI等，1991 ；Hale MI等，1999)。由魏氏梭菌引起的羊魏氏梭菌病，主要發生於羊的毒血症，包括羊猝狙、羊腸毒血症、羔羊痢疾等。該病病死率較高，用抗菌藥物治療療效不明顯，而且不同菌型的魏氏梭菌常常混合感染(王選等，2004 ；劉芳等，2007 ；陳小平等，2008)。隨著近年來規模化養羊的不斷發展，羊流動大、流速快，外引羊群多水土不服，加之冬春草料短缺，飼養管理不當，羊抵抗力下降，魏氏梭菌感染在山羊群中有上升蔓延趨勢。且魏氏梭菌A、B、C、D、E型，皆為土壤常在菌，主要存在於土壤和汙水中，當山羊抵抗力較低時，病原菌在腸道內迅速繁殖而產生大量毒素，毒素大量進入血液而引起發病。各型魏氏梭菌均產生α毒素，α毒素為魏氏梭菌的主要致死性毒素，具有致死、壞死及溶血等活性，其作用於紅血球引起溶血，作用於毛細血管致使滲透作用發生障礙，引起水腫、出血及局部壞死等一系列病變。本研究設計的引物是針對魏氏梭菌A、B、C、D、E型共有的α毒素基因，A、B、C、D、E型均能擴增出特異性條帶。王三虎等(2002)根據α毒素基因建立聚合酶鏈反應診斷魏氏梭菌病，但只檢測了 A型魏氏梭菌。王磊等(2006)根據源魏氏梭菌的α、 β、ε、ι毒素基因，應用多重PCR檢測圈養牛、豬和羊源魏氏梭菌，但敏感性未見其報導。現在市場缺少一種能對臨床樣品的羊魏氏梭菌進行簡便、快捷、靈敏、準確、重複性的檢測的試劑盒。

發明內容
本發明的目的是提供一種羊魏氏梭菌PCR診斷試劑盒，它可以快速檢測羊魏氏梭菌，並且簡便、靈敏、準確、特異性強。本發明是這樣實現的羊魏氏梭菌PCR檢測試劑盒，它包括250 μ L的PCR premix 緩衝液，150 μ L超純水，50 μ L的Marker DL2000,40 μ L濃度為9 IlMmol/L的上引物及 40 μ L濃度為9 llMmol/L的下引物，20 μ L陰性對照以及20 μ L陽性對照。PCR premix 緩衝液由 3 mmol/μ L 的 MgCl2, 500pmol/μ L 的 dNTP，25mmol/yL 的 Tris-HCl 及 0. 2 0. 5U Taq DNA polymerase/μ L 組成，其 PH 值為 ρΗ8· 3。上引物的序列號為LPF 5，- TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG _ 3，，下引物的序列號為 5' -CATAATCCCAATCATCCCAACTA-S'o陰性對照為超純水。
3
陽性對照為標準羊魏氏梭菌的PCR產物。羊魏氏梭菌PCR診斷方法的建立 1材料與方法
1.1細菌
羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型，羊大腸桿菌，羊鏈球菌，金黃色葡萄球菌，羊多殺性巴氏桿菌為貴州省畜牧獸醫研究所畜禽重大疫病監測防制重點實驗室保存。1.2主要試劑
Goldview、Tris、EDTA、DL2000、PCR premix緩衝液等購自寶生物(大連)工程有限公司； TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；引物由寶生物(大連)工程有限公司合成。1.3細菌基因組的抽提
取待檢糞便樣品共約500 mg，加入50(^LPBS緩衝液，待檢樣品研磨後12000 r/min離心取上清用於細菌基因組的提取。細菌基因組的提取參照TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行，將提取的DNA - 20°C保存。1.4 PCR 擴增
參照GenBank中羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型共有的α毒素基因，應用DNAMar軟體，設計了 1對引物，用於擴增A、B、C、D、E型共有的α毒素目的基因片段。上遊引物5，-TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG - 3，； 下遊引物5，- CATAATCCCAATCATCCCAACTA - 3，。PCR反應在25 μ 體系中進行，試劑盒中的上引物和下引物各2PL、PCR premix緩衝液12. 5μ 、抽提的DNA模板WL加超純水7. 5μ 至25 μ ,反應條件94°C預變性5 min ； 940C變性30s，55°C退火1 min，72°C延伸1 min，30個循環；最後72°C延伸10 min。取 5PLPCR擴增產物於10g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑑定。1.5敏感性試驗
將提取的羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型基因組用蛋白質核酸儀測定濃度後，經10倍系列稀釋的核酸用於PCR反應，以確定建立的PCR的敏感性。1.6特異性試驗
以羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型，羊大腸桿菌，羊鏈球菌，金黃色葡萄球菌，羊多殺性巴氏桿菌，空白水對照為模板進行PCR反應，以確定建立的PCR的特異性。1.7重複性試驗
應用建立多重PCR方法，重複檢測DNA樣品3次以檢驗結果的可靠性。1. 8 PCR對臨床樣品的檢測
對2009 2011年貴州省貴陽市、遵義市、安順市、六盤水市、銅仁地區、甕安縣幾個規模化養羊場和養羊專業戶採集的M份病料進行檢測，同時進行細菌學和生化檢驗。2 結果
2.1 PCR產物的鑑定
PCR擴增片段經膠回，送大連寶生物工程有限公司測序，結果表明，擴增片段為羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型共有的α毒素基因片段。2. 2 PCR 反應結果PCR反應在25PL反應體系中最佳反應條件為，退火溫度55°C，引物濃度lOMmol/ L，羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型均有效擴增出了其目的片段，其結果如圖1所示，片段大小為 255bp02. 3敏感性試驗
在PCR反應中，將提取的羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型基因組用蛋白質核酸儀測定濃度後， 經10倍系列稀釋的核酸用於PCR反應，A型為0. 39ng/L、B型為0. 62ng/L、C型為0. 52ng/ L、D型為0. 87ng/L、E型為0. 92ng/L, A型羊魏氏梭菌敏感性試驗結果如圖2所示。2. 4特異性試驗
如圖3所示，羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型為模板均擴增出的特異性條帶，而以羊大腸桿菌，羊鏈球菌，金黃色葡萄球菌，羊多殺性巴氏桿菌，空白水對照為模板進行PCR反應均為陰性。2. 5重複性試驗
應用建立PCR方法，重複檢測羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型細菌基因組3次結果均一致。2. 6 PCR對臨床樣品的檢測
54份臨床病料利用建立的羊魏氏梭菌PCR方法進行檢測，共檢測出40份陽性樣品，高於與細菌學和生化檢驗結果的26份陽性樣品。3 結果
本研究中5個型的魏氏梭菌敏感性差異可能和引物序列以及PCR反應條件有關。本研究中臨床病料檢測結果顯示，靈敏高於與細菌學和生化檢驗，這與魏氏梭菌分離培養對厭氧條件要求較高有關。且細菌的生理生化特性由於寄主不同、環境不同以及實驗室培養條件等方面的不同而產生差異，從而難以鑑定。根據上述實驗結果表明，本發明的靈敏性高、 特異性強、重複性好，可用於羊魏氏梭菌病的早期快速診斷，對羊魏氏梭菌病的預防和治療具有重要的意義。由於採用了上述技術方案，本發明對PCR反應條件進行優化，採用常規PCR法取代了費工費時的生化試驗和血清學監測，研製了用於檢測羊魏氏梭菌病的PCR試劑盒，該試劑盒可以檢測羊魏氏梭菌病，可用於羊魏氏梭菌病的早期快速診斷，對羊魏氏梭菌病的預防和治療具有重要的意義，能避免了人為判定帶來的誤差，縮短了羊魏氏梭菌病的檢出時間，具有快速、靈敏性高、特異性強等特點。本發明檢測結果準確，並且快捷、靈敏，檢測方式簡單，使用效果好。


圖1為魏氏梭菌PCR試驗
M: DL2000 ;1 陰性對照；2:A型PCR結果；3: B型PCR結果；4:C型PCR結果；5: D型 PCR結果；6 =E型PCR結果；
圖2為A型羊魏氏梭菌PCR敏感性試驗 M: D2000 ；1 7 10-1 10"稀釋的 DNA PCR 結果圖3為PCR特異性試驗
M: DL2000 ；1 5 羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型；6 大腸桿菌PCR產物；7 羊鏈球菌PCR 產物；8 金黃色葡萄球菌PCR產物；9:羊多殺性巴氏桿菌PCR產物；10:空白水對照。
具體實施例方式本發明的實施例1 羊魏氏梭菌PCR檢測試劑盒，它包括250 μ L的PCR premix 緩衝液(PCR premix 緩衝液由 3 mmol/μ L 的 MgCl2, 500pmol/μ L 的 dNTP，25mmol/ μ L 的 Tris-HCl 及 0. 2U Taq DNA polymerase/ μ L 組成，其 PH 值為 ρΗ8· 3)，150 μ L 超純水，50μ L的Marker DL2000, 40yL濃度為10Mmol/L的上引物(上引物的序列為LPF 5，- TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG - 3，)及 40 μ L 濃度為 10Mmol/L 的下引物(下引物的序列為5，- CATAATCCCAATCATCCCAACTA - 3，)，20 μ L超純水作為陰性對照以及20 μ L標準羊魏氏梭菌的PCR產物作為陽性對照。本發明的實施例2 羊魏氏梭菌PCR檢測試劑盒，它包括250 μ L的PCR premix 緩衝液(PCR premix 緩衝液由 3 mmol/μ L 的 MgCl2, 500pmol/μ L 的 dNTP，25mmol/ μ L 的 Tris-HCl 及 0. 5U Taq DNA polymerase/ μ L 組成，其 PH 值為 ρΗ8· 3)，150 μ L 超純水，50μ L的Marker DL2000, 40 μ L濃度為9Mmol/L的上引物(上引物的序列為LPF 5，- TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG - 3，)及40 μ L濃度為9Mmol/L的下引物(下引物的序列為 5， - CATAATCCCAATCATCCCAACTA - 3，)，20 μ L超純水作為陰性對照以及20 μ L標準羊魏氏梭菌的PCR產物作為陽性對照。本發明的實施例3 羊魏氏梭菌PCR檢測試劑盒，它包括250 μ L的PCR premix 緩衝液(PCR premix 緩衝液由 3 mmol/μ L 的 MgCl2, 500pmol/μ L 的 dNTP，25mmol/ μ L 的 Tris-HCl 及 0. 4U Taq DNA polymerase/ μ L 組成，其 PH 值為 ρΗ8· 3)，150 μ L 超純水，50μ L的Marker DL2000, 40yL濃度為llMmol/L的上引物(上引物的序列為LPF 5，- TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG - 3，)及 40 μ L 濃度為 llMmol/L 的下引物(下引物的序列為5，- CATAATCCCAATCATCCCAACTA - 3，)，20 μ L超純水作為陰性對照以及20 μ L標準羊魏氏梭菌的PCR產物作為陽性對照。
權利要求
1.一種羊魏氏梭菌PCR檢測試劑盒，其特徵在於它包括250 μ L的PCR premix緩衝液，150 μ L超純水，50 μ L的Marker DL2000，40 μ L濃度為9 IlMmol/L的上引物及40 μ L 濃度為9 llMmol/L的下引物，20 μ L陰性對照以及20 μ L陽性對照。
2.根據權利要求1所述的羊魏氏梭菌PCR檢測試劑盒，其特徵在於PCRpremix緩衝液由 3mmol/y L的MgCl2，500pmol/y L 的 dNTP，25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0. 2 0. 5U Taq DNA polymerase/μ L 組成，其 PH 值為 ρΗ8· 3。
3.根據權利要求1所述的羊魏氏梭菌PCR檢測試劑盒，其特徵在於上引物的序列號為LPF 5，- TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG - 3，，下引物的序列號為 5' -CATAATCCCAATCATCCCAACTA-S'o
4.根據權利要求1所述的羊魏氏梭菌PCR檢測試劑盒，其特徵在於陰性對照為超純水。
5.根據權利要求1所述的羊魏氏梭菌PCR檢測試劑盒，其特徵在於陽性對照為標準羊魏氏梭菌的PCR產物。
全文摘要
本發明公開了一種羊魏氏梭菌PCR檢測試劑盒，它包括250μL的PCRpremix緩衝液，150μL超純水，50μL的MarkerDL2000，40μL濃度為10μmol/L的上引物及40μL濃度為10μmol/L的下引物，20μL陰性對照以及20μL陽性對照。本發明對PCR反應條件進行優化，採用常規PCR法取代了費工費時的生化試驗和血清學監測，研製了用於檢測羊魏氏梭菌病的PCR試劑盒，該試劑盒可以檢測羊魏氏梭菌病，可用於羊魏氏梭菌病的早期快速診斷，對羊魏氏梭菌病的預防和治療具有重要的意義，能避免了人為判定帶來的誤差，縮短了羊魏氏梭菌病的檢出時間，具有快速、靈敏性高、特異性強等特點。
文檔編號C12Q1/04GK102242221SQ20111020361
公開日2011年11月16日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者餘波, 冉懋韜, 徐景峨, 艾玉萍, 譚詩文, 魏賜開 申請人:貴州省畜牧獸醫研究所