一種龍膽的組織培養快速繁殖方法
2023-07-27 09:54:41
一種龍膽的組織培養快速繁殖方法
【專利摘要】一種龍膽的組織培養快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)取龍膽為開裂果實作為外植體進行消毒；(2)將消毒後的外植體在超淨工作檯撥開，將種子抖落到MS培養基上誘導發芽得到無菌試管苗；(3)將所述無菌試管苗置於MS繁殖培養基中進行試管苗快速繁殖培養獲得叢生芽；(4)將所述叢生芽置於MS生根培養基中培養得到完整的帶根苗；(5)取完整的帶根苗進行煉苗後移植於苗床生長一個月，再移栽至大田。採用本發明所述的培養方法得到的龍膽叢生芽增殖係數達到15-20倍，獲得的組培苗生根率達到99.5％，移栽苗床成活率達到98％，有效解決了龍膽的規模化育苗問題。
【專利說明】一種龍膽的組織培養快速繁殖方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物繁殖方法，特別是一種龍膽的組織培養快速繁殖方法。
【背景技術】
[0002]龍膽，拉丁學名Gentiana scabra Bunge,也稱龍膽草,膽草、草龍膽、山龍膽，為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，為藥材龍膽草的基源植物之一，以根與根莖入藥，具有清肝膽、瀉下焦溼熱等功效，主要用於治療能治頭脹頭疼、目赤腫疼、溼熱黃疸、小便淋疼、陰腫陰癢、帶下、抽搐、驚風等疾病。現代研究認為其主要有效成分為龍膽苦苷具有抗炎、鎮痛、耐缺氧，以及抗疲勞等作用。
[0003]龍膽草是我國大宗常用中藥材，市場需求量大，長期供不應求，在過去三十幾年一直列入國家和省管理的統配品種，但鮮有人工種植，主要來源於野生資源。近年來，由於亂墾、亂牧、亂採挖致使野生資源遭到嚴重破壞，藥材的蘊藏量越來越少，野生資源趨於枯竭，可能有絕種的危險，因此於1989年被列入國家重點發展的保護品種，是重點推薦發展的63種緊缺中藥材之一。為了保護珍貴的野生資源，促進龍膽的可持續發展，滿足市場的需求，需要加快推進龍膽的中藥產業現代化進程，尋找更加快速的繁苗方法，以推動人工種植的發展。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種龍膽的組織培養快速繁殖方法，它能夠提高龍膽種苗的繁殖速度和質量，實現龍膽優質種苗的工廠化育苗，以滿足生產上的需要。
[0005]本發明通過以下技術方案達到上述目的:一種龍膽的組織培養快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0006](I)外植體的選擇與消毒:取龍膽的成熟為開裂果實作為外植體，依次用2%洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水衝洗15-30min、添加了 2_3滴吐溫-20的100毫升0.1%升汞消毒10-12min、無菌水衝洗3_5次，最後用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水；
[0007](2)種子萌發獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體在超淨工作檯上剝開，將種子抖落到MS培養基中，在培養溫度為23-27°C，光照強度15001uX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養30天，種子發芽後獲得無菌試管苗，其中MS培養基中含0.2mg/L的苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8 ;
[0008](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養:將步驟(2)中得到的無菌試管苗置於MS繁殖培養基中，在培養溫度23-27°C，光照強度15001uX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養30天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養基中含0.5-2.5mg/L的苄基腺嘌呤6-BA、0.1-0.3mg/L的吲哚乙酸IAA、0.0-0.2mg/L的激動素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養基的PH值為5.8 ；
[0009](4)叢生芽生根培養:將步驟(3)中得到的叢生芽切成帶頂芽或葉芽的莖段，置於1/2MS生根培養基中，在培養溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為12-14小時/天的條件下培養30天得到帶根的完整植株，其中1/2MS生根培養基中含0.1-0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.3mg/L的生根粉ABT、0_0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊月旨，培養基的pH值為5.8 ；
[0010](5)煉苗與移栽:步驟(4)獲得帶根的完整植株後，在室溫為25°C的室內打開瓶蓋，在瓶中加入少量自來水，煉苗2-4天，表面角質形成後將苗取出，洗淨根部培養基，立即移栽到苗床中，在苗床中生長一個月後移栽大田。
[0011]移栽後一個星期內，每天早8點到晚6點噴霧3-5次，每次lOmin，此後每天早8點、晚6點各噴霧I次，每次1min ;移栽時的溫度條件為20_28°C，相對溼度75-80%，遮陽率為60%。
[0012]本發明的突出優點在於:
[0013](I)採用組織培養技術繁育龍膽種苗具有繁殖速度快、種苗質量均一，且不受時間、空間、季節限制等突出優點，縮短了種苗繁育周期，提高了種苗質量，實現規模化生產，滿足生產上的需要。
[0014](2)在本發明所述的培養體系上得到的龍膽叢生芽增殖係數達到15-20倍，叢生芽健康粗壯，無玻璃化現象，接種到含有生根粉吲哚乙酸IAA、生根粉ABT的1/2MS生根培養基上，獲得的組培苗生根率達到99.5%，煉苗後移栽苗床成活率達到98%。
【具體實施方式】
[0015]下面結合實施例對本發明的技術方案進一步說明。
[0016]本發明所述的龍膽的組織培養快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0017](I)外植體的選擇與消毒:取龍膽的成熟為開裂果實作為外植體，依次用2%洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水衝洗15-30min、添加了 2_3滴吐溫-20的100毫升0.1%升汞消毒10-12min、無菌水衝洗3_5次，最後用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水。
[0018](2)種子萌發獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體在超淨工作檯上剝開，將種子抖落到MS培養基中，在培養溫度為23-27°C，光照強度15001uX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養30天，種子發芽後獲得無菌試管苗，其中MS培養基中含0.2mg/L的苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8。
[0019](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養:將步驟(2)中得到的無菌試管苗置於MS繁殖培養基中，在培養溫度23-27°C，光照強度15001uX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養30天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養基中含表1所列的不同濃度的苄基腺嘌呤6-BA、吲哚乙酸IAA、和激動素KT,以及30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8。由表1的結果看出，苄基腺嘌呤6-BA對龍膽叢生芽的亞增殖倍率具有顯著影響，隨著苄基腺嘌呤6-BA濃度的增加，亞增殖倍率迅速增加。三種激素對龍膽亞增殖倍率的影響順序為A>C>B，最佳配比為A3B2C3，即MS培養基中添加2.5mg/L的苄基腺嘌呤6_BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA和0.2mg/L的激動素KT增殖效果最好，增殖倍率達到20倍以上。
[0020]表1不同激素對龍膽組織培養快速繁殖效果的影響
[0021]
【權利要求】
1.一種龍膽的組織培養快速繁殖方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟: (1)外植體的選擇與消毒:取龍膽的成熟為開裂果實作為外植體，依次用2%洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水衝洗15-30min、添加了 2_3滴吐溫-20的100毫升0.1%升汞消毒10-12min、無菌水衝洗3_5次，最後用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水， (2)種子萌發獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體在超淨工作檯上剝開，將種子抖落到MS培養基中，在培養溫度為23-27°C，光照強度15001uX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養30天，種子發芽後獲得無菌試管苗，其中MS培養基中含0.2mg/L的苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8， (3)試管苗叢生芽快速繁殖培養:將步驟(2)中得到的無菌試管苗置於MS繁殖培養基中，在培養溫度23-27°C，光照強度15001UX，光照時間為12-14小時/天的條件下培養30天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養基中含0.5-2.5mg/L的苄基腺嘌呤6_BA、0.1-0.3mg/L的吲哚乙酸IAA、0.0-0.2mg/L的激動素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養基的pH值為 5.8， (4)叢生芽生根培養:將步驟(3)中得到的叢生芽切成帶頂芽或葉芽的莖段，置於1/2MS生根培養基中，在培養溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為12-14小時/天的條件下培養30天得到帶根的完整植株，其中1/2MS生根培養基中含0.1-0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.3mg/L的生根粉ABT、0_0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊月旨，培養基的pH值 為5.8， (5)煉苗與移栽:步驟(4)獲得帶根的完整植株後，在室溫為25°C的室內打開瓶蓋，在瓶中加入少量自來水，煉苗2-4天，表面角質形成後將苗取出，洗淨根部培養基，立即移栽到苗床中，在苗床中生長一個月後移栽大田。
【文檔編號】A01H4/00GK104067939SQ201410299280
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月26日 優先權日:2014年6月26日
【發明者】韋坤華, 李林軒, 繆劍華, 韋瑩, 李翠, 劉凡, 韋範, 黃寶優, 林偉 申請人:廣西壯族自治區藥用植物園