相輔脫氧核糖核酸的合成方法

2023-07-27 14:25:31

專利名稱：相輔脫氧核糖核酸的合成方法
技術領域：
本發明涉及一種相輔脫氧核糖核酸(cDNA)的合成方法。
cDNA在正常的生物體細胞內並不存在，cDNA需藉助於逆轉錄酶以信使核糖核酸(mRNA)為模板在試管內合成，合成後的cDNA為信使核糖核酸的拷貝，因而帶有該信使核糖核酸的全部遺傳信息，是當今基因克隆、分析(包括基因晶片)及功能蛋白質表達的必不可少的中介物質。
穩定和實用的cDNA為雙鏈結構，其第一鏈合成是如上所述的逆轉錄酶完成的，其第二鏈的合成可分為兩大類1)用傳統的(非耐熱的)聚合酶合成cDNA第二鏈(如大腸桿菌DNA聚合酶I全酶或Klenow片斷，T4、T7λ噬菌體DNA聚合酶等)。
2)用多聚酶鏈式反應(PCR)合成cDNA第二鏈，PCR用酶都是耐熱性的DNA聚合酶，如Taq，Klentaq，Tth等DNA聚合酶。
眾所周知，用傳統的聚合酶合成cDNA第二鏈的保真性好但合成量低，一般為起始信使核糖核酸模板量的80％-90％，而用多聚酶鏈式反應(PCR)擴增合成cDNA第二鏈易產生點變異(PCR酶的保真性差)，但由於PCR擴增，雙鏈cDNA為傳統方法的10-20倍，這種生產量可以滿足工業化大生產的要求，其中由於PCR所產生的點變異，在某些應用(如cDNA晶片的生產)上可忽略不計，或可以用低循環PCR降低或去除PCR酶產生的點變異，雖然低循環PCR(3-5循環)的得率(合成量)要比標準PCR(25-30循環)低得多，但還是比用傳統的聚合酶合成cDNA第二鏈的得率還是高。
把PCR技術應用到cDNA合成必然會碰到的技術問題是如何把PCR引物銜接頭，又稱「通用序列」無差異地加到每一個cDNA分子上去？眾所周知，天然的信使核糖核酸(mRNA)分子存在3』端poly(A)尾部，因而用oligo(dT)轉錄成第一鏈的cDNA後，自然在其總體cDNA的5』端形成一個天然PCR通用序列，欲施行總體cDNA PCR擴增，必需在5』端和3』都具有供引物結合的通用序列，如何在數以萬計的總體第一鏈cDNA的3』端高效加上一個PCR通用序列是一個技術難點，現有技術，如末端轉移酶催化的同聚物GC加尾，由於無法控制加尾長度，而且GC富集區本身會抑制PCR反應，故實用過程中不理想，用連接酶催化的磷酸接頭的連接反應，對單鏈DNA的連接效果極差，對雙鏈DNA的連接亦不穩定，而且連接反應中如存在非mRNA汙染序列，會在以後的PCR反應中得到擴增影響到cDNA的純度，所以連接反應所需要的起始物為mRNA，而且使用量亦大。
本發明的目的在於提供一種可在全部第一鏈cDNA的3』端簡易、高效加上一個PCR通用序列，進而實現總體cDNA PCR擴增的cDNA的合成方法。
本發明的技術解決方案是一種cDNA的合成方法，其特徵在於包括下列步驟(1)用常規方法人工合成下列結構式的DNA-RNA或RNA供體分子5』-----------------****3』，包括①5』OOOOOOOOOOOOOO-GNGG3』②5』OOOOOOOOOOOOOO-NGGG3』③5』OOOOOOOOOOOOOO-NNGG3』④5』OOOOOOOOOOOOOO-GNG3』⑤5』OOOOOOOOOOOOOO-GGN3』⑥5』OOOOOOOOOOOOOO-NGG3』其中Poly＂O＂代表隨意DNA或RNA序列，包括25～35個鹼基，是引物的結合部位；「G」代表RNA鹼基G，「N」代表RNA鹼基A或T、G、C；(2)用鼠源逆轉錄酶M-MLV採用常規方法以mRNA為模板合成第一鏈cDNA，在合成第一鏈cDNA的同時，加入上述供體分子，發生如下方式的逆轉錄和模板轉換反應當合成第一鏈cDNA到達mRNA的5』端，第一鏈cDNA在3』端具有加尾功能而形成的cDNA受體分子，通過分子相輔結合，該受體分子接受反應液中的供體分子，逆轉錄酶繼續把供體分子作為模板繼續轉錄而合成一條和供體分子相輔的序列，即PCR通用序列，也即PCR引物結合部位；5』---------****3』供體分子PolyA尾5』------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAAAAAAAA3』3』←----------****yyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyT TTT T TTT5』受體分子 oligo-d(T)其中＂x＂代表mRNA，＂y＂代表第一鏈cDNA；(3)用常規PCR擴增方法合成cDNA第二鏈，並生成大量擴增產物。5』端引物5』 -----------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAAAA3』3』 -----------------****yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyTT T TTT T T5』←-----------3』端引物本發明通過在全部第一鏈cDNA的3』端簡易、高效加上一個PCR通用序列，進而高效實現總體cDNA PCR擴增，其擴增產物可廣泛用於cDNA晶片生產、cDNA文庫的建立與生產、cDNA探針的合成以及起始RNA量受限制時的應用等方面。
下面結合實施例對本發明作進一步說明。
實施例一種cDNA的合成方法，其特徵在於包括下列步驟(1)用常規方法(採用核酸合成儀)人工合成下列結構式的DNA-RNA或RNA供體分子5』-----------------****3』，包括①5』OOOOOOOOOOOOOO-GNGG3』②5』OOOOOOOOOOOOOO-NGGG3』③5』OOOOOOOOOOOOOO-NNGG3』④5』OOOOOOOOOOOOOO-GNG3』⑤5』OOOOOOOOOOOOOO-GGN3』⑥5』OOOOOOOOOOOOOO-NGG3』其中Poly＂O＂代表隨意DNA或RNA序列，包括25～35個鹼基，是引物的結合部位；「G」代表RNA鹼基G，「N」代表RNA鹼基A或T、G、C，由於供體分子是供鼠源逆轉錄酶M-MLV催化之用，其通式是供體分子的3』端的最後3個RNA序列中的「G」要佔50％以上，因為鼠源逆轉錄酶M-MLV本身具有末端轉移酶活性，但加尾時以dc為主，以其它三種為輔。
(2)用鼠源逆轉錄酶M-MLV採用常規方法以mRNA為模板合成第一鏈cDNA，在合成第一鏈cDNA的同時，加入上述供體分子，發生如下方式的逆轉錄和模板轉換反應當合成第一鏈cDNA到達mRNA的5′端，第一鏈cDNA在3』端具有加尾功能而形成的cDNA受體分子，通過分子相輔結合，該受體分子接受反應液中的供體分子，逆轉錄酶繼續把供體分子作為模板繼續轉錄而合成一條和供體分子相輔的序列，即PCR通用序列，也即PCR引物結合部位；5』---------****3』供體分子PolyA尾5』 -------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAAAAA3』3』 ←-----------****yyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyT TTT T TTT5』受體分子oligo-d(T)其中＂x＂代表mRNA，＂y＂代表第一鏈cDNA；(3)用常規PCR擴增方法合成cDNA第二鏈，並生成大量擴增產物。5』端引物-----→5』 ------------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAAAAAA3』3』 ------------------****yyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyTTT TTT T T5』←---------3』端引物
權利要求
1.一種cDNA的合成方法，其特徵在於包括下列步驟(1)用常規方法人工合成下列結構式的DNA-RNA或RNA供體分子5』-------------------****3』，包括①5』OOOOOOOOOOOOOO-GNGG3』②5』OOOOOOOOOOOOOO-NGGG3』③5』OOOOOOOOOOOOOO-NNGG3』④5』OOOOOOOOOOOOOO-GNG3』⑤5』OOOOOOOOOOOOOO-GGN3』⑥5』OOOOOOOOOOOOOO-NGG3』其中Poly＂O＂代表隨意DNA或RNA序列，包括25～35個鹼基，是引物的結合部位；「G」代表RNA鹼基G，「N」代表RNA鹼基A或T、G、C；(2)用鼠源逆轉錄酶M-MLV採用常規方法以mRNA為模板合成第一鏈cDNA，在合成第一鏈cDNA的同時，加入上述供體分子，發生如下方式的逆轉錄和模板轉換反應當合成第一鏈cDNA到達mRNA的5』端，第一鏈cDNA在3』端具有加尾功能而形成的cDNA受體分子，通過分子相輔結合，該受體分子接受反應液中的供體分子，逆轉錄酶繼續把供體分子作為模板繼續轉錄而合成一條和供體分子相輔的序列，即PCR通用序列；5』---------****3』供體分子PolyA尾5』 ---------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAA3』3』←--------------****yyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyT TTT T TTT5』受體分子 oligo-d(T)其中＂x＂代表mRNA，＂y＂代表第一鏈cDNA；(3)用常規PCR擴增方法合成cDNA第二鏈，並生成大量擴增產物。5』端引物-----→5』 -------------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAAAAA3』3』 -------------------****yyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyTT T TTT T T5』←-------3』端引物
全文摘要
本發明公開了一種cDNA的合成方法,包括人工合成DNA－RNA或RNA供體分子、用鼠源逆轉錄酶以mRNA為模板合成第一鏈cDNA,在合成第一鏈cDNA的同時,加入上述供體分子進行逆轉錄和模板轉換反應、用PCR擴增方法合成cDNA第二鏈。本發明通過在全部第一鏈cDNA的3』端簡易、高效加上一個PCR通用序列,進而高效實現總體cDNA PCR擴增。
文檔編號C12P19/00GK1380421SQ0111352
公開日2002年11月20日 申請日期2001年4月10日 優先權日2001年4月10日
發明者朱遠源 申請人:朱遠源