製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法及硫酸慶大黴素酶聯免疫快速檢測方法

2023-08-11 03:30:56

專利名稱：製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法及硫酸慶大黴素酶聯免疫快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法及硫酸慶大黴素檢測方法。
背景技術：
硫酸慶大黴素作為一種常用的抗生素被廣泛的應用於農、畜、禽、林和水產品的病蟲害防治，由於使用者的濫用常常出現硫酸慶大黴素殘留量大的問題。硫酸慶大黴素殘留會嚴重危害人類的健康和我國畜禽產品及水產品的出口，所以要對食品進行嚴格的安全檢測。目前檢測硫酸慶大黴素的方法有色譜檢測法和微生物檢測法，但存在檢測時間長的問題，而且色譜檢測法樣品前處理操作難度大、無法檢測微量殘留、無法定量分析。面對高速發展的時代和快速、簡便、準確檢測的需要，目前的這些硫酸慶大黴素檢測法都無法滿足要求。

發明內容
本發明的目的是為了解決目前硫酸慶大黴素檢測法檢測時間長的問題，而提供的一種製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法及硫酸慶大黴素酶聯免疫快速檢測方法。製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法如下(1)取0.17g硫酸慶大黴素分別與0.12g牛血清白蛋白和0.12g卵清白蛋白溶解於20mL、pH值為6.8的磷酸鹽緩衝液，再分別加入濃度為2.5％的戊二醛10mL，攪拌28～32h；(2)在pH值為7.0的磷酸鹽緩衝液中透析6～8h，微孔膜收集抗原硫酸慶大黴素蛋白偶聯物；(3)取2mL硫酸慶大黴素牛血清白蛋白偶聯物與8mL完全福氏佐劑或8mL不完全福氏佐劑乳化，每隻鼠腹腔內注射乳化抗原0.2mL，加強免疫注射硫酸慶大黴素，直到抗體效價為1∶16以上；(4)分離血清；(5)採用硫酸銨鹽析法分離血清中的抗體，再以DEAE-離子交換劑法純化抗體；(6)梯度稀釋抗體，並用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉；(7)梯度稀釋抗原硫酸慶大黴素卵清白蛋白偶聯物；(8)採用免疫反應棋盤法選擇抗原抗體反應的工作濃度按棋盤法將梯度稀釋的抗原硫酸慶大黴素卵清白蛋白偶聯物加入梯度稀釋的抗體中酶聯，反應完全後用TMB顯色；(9)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，挑選OD450值為1～1.5的孔，以所選孔中抗體的稀釋倍數作為工作濃度，並通過抗原稀釋的倍數計算、繪製出標準曲線。硫酸慶大黴素酶聯免疫快速檢測方法步驟如下(一)抗體按上述標準曲線繪製得出的工作濃度稀釋，製成包被液後加入ELISA檢測板，再用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉，然後按繪製上述標準曲線過程中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比加入經梯度稀釋的樣品，再在41℃條件下酶聯反應1～1.5h並用TMB顯色；(二)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，選擇OD450值為0.4～1.5的樣品稀釋液；(三)根據上面所述繪製出的標準曲線查出對應數值再乘以樣品的稀釋倍數，即得出樣品硫酸慶大黴素殘留量。本發明可以通過顏色改變快速做出定性分析，3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)作為反應底物溶液，無抗原混合液為藍色，有抗原混合液則變為黃色，根據顏色的變化可進行定性分析；而且特異性強，3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)遇到硫酸慶大黴素催化其發生水解、氧化或還原反應，形成有色、發光或螢光產物易於識別。酶聯免疫測定法是根據酶標記的抗體或抗抗體來進行的抗原-抗體反應。由於酶的專一性催化和放大反應的作用；所以本發明靈敏度高，準確度高，可檢測至ng級，從而可檢測出極微量硫酸慶大黴素的存在。本發明一次可作多份樣品檢測，更適宜於處理大批量樣品。本發明檢測時間短為1～1.5h，比傳統酶聯免疫法快2～3h。本發明檢測方法簡單易行，可獨立操作，而且成本低不足進口試劑盒價格的一半，更易於推廣使用。


圖1是根據具體實施方式
九繪製出的標準曲線圖。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法如下(1)取0.17g硫酸慶大黴素分別與0.12g牛血清白蛋白和0.12g卵清白蛋白溶解於20mL、pH值為6.8的磷酸鹽緩衝液，再分別加入濃度為2.5％的戊二醛10mL，攪拌28～32h；(2)在pH值為7.0的磷酸鹽緩衝液中透析6～8h，微孔膜收集抗原硫酸慶大黴素蛋白偶聯物；(3)取2mL硫酸慶大黴素牛血清白蛋白偶聯物與8mL完全福氏佐劑或8mL不完全福氏佐劑乳化，每隻鼠腹腔內注射乳化抗原0.2mL，加強免疫注射硫酸慶大黴素，直到抗體效價為1∶16以上；(4)分離血清；(5)採用硫酸銨鹽析法分離血清中的抗體，再以DEAE-離子交換劑法純化抗體；(6)梯度稀釋抗體，並用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉；(7)梯度稀釋抗原硫酸慶大黴素卵清白蛋白偶聯物；(8)採用免疫反應棋盤法選擇抗原抗體反應的工作濃度按棋盤法將梯度稀釋的抗原硫酸慶大黴素卵清白蛋白偶聯物加入梯度稀釋的抗體中酶聯，反應完全後用TMB顯色；(9)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，挑選OD450值為1～1.5的孔，以所選孔中抗體的稀釋倍數作為工作濃度，並通過抗原稀釋的倍數計算、繪製出標準曲線。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(8)中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比為1∶1～10。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(5)中採用飽和硫酸銨三步法分離抗體。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(5)中製備的抗體於4℃環境中保藏。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(3)中加強免疫小鼠每隻注射硫酸慶大黴素0.227mg。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施方式
六本實施方式硫酸慶大黴素酶聯免疫快速檢測方法步驟如下(一)抗體按具體實施方式
一得出的工作濃度稀釋，製成包被液後加入ELISA檢測板，再用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉，然後按繪製具體實施方式
一標準曲線過程中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比加入經梯度稀釋的樣品，再在41℃條件下酶聯反應1～1.5h並用TMB顯色；(二)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，選擇OD450值為0.4～1.5的樣品稀釋液；(三)根據具體實施方式
一繪製出的標準曲線查出對應數值再乘以樣品的稀釋倍數，即得出樣品硫酸慶大黴素殘留量。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
六的不同點是步驟(一)中抗體稀釋200×，製成包被液。其它步驟與實施方式六相同。
抗體稀釋200×為抗體最佳工作濃度。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
六的不同點是步驟(一)中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比為1∶1～10。其它步驟與實施方式六相同。
具體實施方式
九本實施方式檢測硫酸慶大黴素。首先是繪製標準曲線(1)取0.17g硫酸慶大黴素分別與0.12g牛血清白蛋白和0.12g卵清白蛋白溶解於20mL、pH值為6.8的磷酸鹽緩衝液，再分別加入濃度為2.5％的戊二醛10mL，攪拌30h；(2)在pH值為7.0的磷酸鹽緩衝液中透析7h，微孔膜收集抗原硫酸慶大黴素蛋白偶聯物；(3)取2mL硫酸慶大黴素牛血清白蛋白偶聯物和8mL福氏完全佐劑乳化，每隻鼠腹腔內注射乳化抗原0.2mL，加強免疫每隻小鼠注射硫酸慶大黴素0.227mg，直到抗體效價為1∶16以上，採用雙向瓊脂擴散實驗測定抗體效價；(4)分離血清；(5)採用飽和硫酸銨三步法分離血清中的抗體，再以DEAE-離子交換劑法純化抗體；(6)梯度稀釋抗體，並用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉；(7)梯度稀釋抗原硫酸慶大黴素卵清白蛋白偶聯物；(8)採用免疫反應棋盤法選擇抗原抗體反應的工作濃度按棋盤法將梯度稀釋的抗原硫酸慶大黴素卵清白蛋白偶聯物加入梯度稀釋的抗體中酶聯，抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比為1∶1，反應完全後用TMB顯色，混合液變為黃色；(9)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，挑選OD450值為1～1.5的孔，所選孔中抗體稀釋200×，以抗體稀釋200×作為工作濃度，並通過抗原稀釋的倍數計算、制出標準曲線和標準數據表，標準曲線如圖1所示，圖1中曲線R2＝0.9847(R2值≥0.97的點可取為線性點)符合y＝-0.0064x+1.3788的直線公式，標準數據表如表1所示，表1中n為抗原稀釋的倍數。
選取樣品進行硫酸慶大黴素酶聯免疫快速檢測(一)抗體按工作濃度稀釋200×，製成包被液後加入ELISA檢測板，再用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉，然後按1∶1體積比向包被液中加入經梯度稀釋的樣品，再在41℃條件下酶聯反應1.1～1.4h並用TMB顯色，混合液仍為藍色證明樣品中無硫酸慶大黴素殘留，混合液變為黃色證明樣品中有硫酸慶大黴素殘留；(二)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量變色混合液的OD值，選擇OD450值為0.4～1.5的樣品稀釋液；(三)根據標準曲線圖1和標準數據表表1查出的數值再乘以樣品對應的稀釋倍數n，即得出樣品硫酸慶大黴素殘留量。
表1

權利要求
1.製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法，其特徵在於製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法如下(1)取0.17g硫酸慶大黴素分別與0.12g牛血清白蛋白和0.12g卵清白蛋白溶解於20mL、pH值為6.8的磷酸鹽緩衝液，再分別加入濃度為2.5％的戊二醛10mL，攪拌28～32h；(2)在pH值為7.0的磷酸鹽緩衝液中透析6～8h，微孔膜收集抗原硫酸慶大黴素蛋白偶聯物；(3)取2mL硫酸慶大黴素牛血清白蛋白偶聯物與8mL完全福氏佐劑或8mL不完全福氏佐劑乳化，每隻鼠腹腔內注射乳化抗原0.2mL，加強免疫注射硫酸慶大黴素，直到抗體效價為1∶16以上；(4)分離血清；(5)採用硫酸銨鹽析法分離血清中的抗體，再以DEAE-離子交換劑法純化抗體；(6)梯度稀釋抗體，並用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉；(7)梯度稀釋抗原硫酸慶大黴素卵清白蛋白偶聯物；(8)採用免疫反應棋盤法選擇抗原抗體反應的工作濃度按棋盤法將梯度稀釋的抗原硫酸慶大黴素卵清白蛋白偶聯物加入梯度稀釋的抗體中酶聯，反應完全後用TMB顯色；(9)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，挑選OD450值為1～1.5的孔，以所選孔中抗體的稀釋倍數作為工作濃度，並通過抗原稀釋的倍數計算、繪製出標準曲線。
2.根據權利要求1所述的製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法，其特徵在於步驟(8)中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比為1∶1～10。
3.根據權利要求1所述的製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法，其特徵在於步驟(5)中採用飽和硫酸銨三步法分離抗體。
4.根據權利要求1所述的製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法，其特徵在於步驟(5)中製備的抗體於4℃環境中保藏。
5.根據權利要求1所述的製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法，其特徵在於步驟(3)中加強免疫小鼠每隻注射硫酸慶大黴素0.227mg。
6.硫酸慶大黴素酶聯免疫快速檢測方法，其特徵在於硫酸慶大黴素酶聯免疫快速檢測方法步驟如下(一)抗體按權利要求1得出的工作濃度稀釋，製成包被液後加入ELISA檢測板，再用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉，然後按繪製權利要求1標準曲線過程中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比加入經梯度稀釋的樣品，再在41℃條件下酶聯反應1～1.5h並用TMB顯色；(二)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，選擇OD450值為0.4～1.5的樣品稀釋液；(三)根據權利要求1繪製的標準曲線查出對應數值再乘以樣品的稀釋倍數，即得出樣品硫酸慶大黴素殘留量。
7.根據權利要求6所述的硫酸慶大黴素酶聯免疫快速檢測方法，其特徵在於步驟(一)中抗體稀釋200×，製成包被液。
8.根據權利要求6所述的硫酸慶大黴素酶聯免疫快速檢測方法，其特徵在於步驟(一)中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比為1∶1～10。
全文摘要
製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法及硫酸慶大黴素酶聯免疫快速檢測方法，它涉及一種製作硫酸慶大黴素檢測標準曲線的方法及硫酸慶大黴素檢測方法。它解決了目前硫酸慶大黴素檢測法檢測時間長的問題。繪標準曲線蛋白與硫酸慶大黴素偶聯後注射入小鼠體內製備抗體，再用免疫反應棋盤法選擇抗原抗體反應的工作濃度，然後挑選OD
文檔編號G01N33/543GK1928559SQ200610010569
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月18日 優先權日2006年9月18日
發明者王靜, 曹維強, 丁志剛, 金芬, 邵華, 楊錨 申請人:中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所