使用食品級乳酸菌生產和遞送的口服幹擾素及其製備方法
2023-08-11 07:13:21 1
使用食品級乳酸菌生產和遞送的口服幹擾素及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種可以口服的，表達人或者動物來源的幹擾素的食品級重組乳酸菌及其製備方法。其特徵在於：幹擾素的編碼基因在誘導型或者組成型啟動子的控制下，與信號肽、錨定子結合，組成完整的表達框(expression?cassette)。該表達框被插入到thyA缺失的條件致死型乳酸菌突變株的染色體，或者質粒上，用於幹擾素在乳酸菌細胞內、細胞外、或者細胞壁錨定表達。本發明所述的重組乳酸菌是食品級的，不含外源抗生素抗性基因，可以用於直接口服抗病毒治療。
【專利說明】使用食品級乳酸菌生產和遞送的口服幹擾素及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種表達和遞送幹擾素的食品級重組乳酸菌及其製備方法。更具體地說，本發明涉及一種可以大規模生產的，適用於人和動物幹擾素表達的食品級重組乳酸菌，用於人和動物的抗病毒治療。
【背景技術】
[0002]幹擾素(interferon，IFN)是多功能細胞因子家族中的一員，是一種具有廣泛的抗病毒抗腫瘤和免疫調節活性的糖蛋白，是人或者動物體防禦系統的重要組成部分。幹擾素通過與特定細胞表面受體結合發生的，隨後激活細胞信號傳導的通路，並且誘導一系列受幹擾素調控基因的表達，刺激細胞內多種效應蛋白質的分子合成，從而幹擾感染病毒的複製。
[0003]幹擾素按國際標準分為三大類，每一類幹擾素有不同型，每一型又可被分成不同的亞型。其中 I 類幹擾素(IFN-1)包括 IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN- τ、IFN- δ、IFN-κ、人IFN- ε、IFN- ζ。II類幹擾素(IFN-1I)中只包括IFN- Y，它的主要作用是激活巨噬細胞的殺滅微生物的作用；ΠΙ類幹擾素(IFN-1II)指IFN-λ，分IFN-X-1，2和3三個亞型，也稱為IL-28A，IL-28B和IL-29，與IFN-1相似，IFN-1II主要在對病毒的自然免疫中在為數不多的幾種細胞中起作用。
[0004]隨著分子生物學的迅速發展，人們利用基因工程的方法已經成功的在體外大規模合成了幹擾素，並生產了許多生物製品。目前用於幹擾素生產的表達系統和生物發酵器主要是大腸桿菌和酵母菌。
[0005]在臨床上，幹擾素已經應用於人類流行感冒、帶狀皰疹、B型肝炎和癌症治療。動物幹擾素的臨床使用率要遠遠落後於人幹擾素的應用，這主要是因為幹擾素製劑的生產成本較高、幹擾素藥效持久性和穩定性差、動物種間差異大，需要的幹擾素品種繁多，市場還不能滿足其多樣性的需求等。因此，開發生產成本低，使用方便，針對多物種的幹擾素產品已經成為業內追求的發展方向。
[0006]專利CN1324951A公布了使用昆蟲杆狀病毒表達載體在昆蟲細胞表達生產人乙型幹擾素的方法；專利CN100999729A公布了使用昆蟲杆狀病毒表達載體在昆蟲細胞表達生產牛Y -幹擾素的方法；專利CN101054584A公布了在大腸桿菌表達鯽魚乾擾素的方法?』專利CN101603033A公布了使用CHO細胞系表達牛β -幹擾素的方法；專利CN102154307公布了使用大腸桿菌製備雞β-幹擾素的方法；
[0007]通過基因工程手段表達和生產幹擾素是一種經濟、高效的方法，但由於上述專利所使用的表達宿主都不是食品級微生物，所生產的幹擾素都必須經過純化後注射使用，不能直接用於口服。
[0008]近年來，隨著乳酸菌基因組學的不斷發展和遺傳操作工具的不斷豐富，以活體乳酸菌為遞送載體的藥物遞送逐漸成為乳酸菌應用研究的一個熱點。乳酸菌是一個十分良好的蛋白質和多肽類藥物的遞送載體，因為它是人體的益生菌，適應腸道環境，並可以定殖到小腸內壁的上皮細胞。
[0009]專利CN101538572A公布了含有重組人a _2b幹擾素的重組乳酸菌及其應用方法。但在該發明專利中，人a -2b幹擾素的編碼基因位於Nisin誘導型表達質粒載體，而非染色體上，在人a _2b幹擾素實際生產中仍受到很大限制，且不適宜直接口服。
[0010]本發明提供了一種使用乳酸菌作為生產和遞送載體的，可以口服，適於大規模生產的幹擾素及其製備方法。該方法可以將幹擾素編碼基因在非誘導型啟動子的控制下，整合到表達宿主乳酸菌的染色體上，從而獲得穩定遺傳。由於幹擾素編碼基因都很小，本發明所提供的方法中，省略了依賴傳統基因工程方法繁瑣的表達載體構建程序，直接將設計好的完整表達框通過人工合成獲得。在基因合成的同時，可以優化密碼子使用偏好。另外，不同物種來源的幹擾素具有良好的相似性，該方法廣泛適用於人及動物幹擾素的生產和遞送，如人、豬、牛、雞、犬、狐、鴨、羊、魚等。
[0011]使用食品級乳酸菌生產和遞送幹擾素具有如下優勢:[0012]I)乳酸菌自身耐酸，可以順利穿過胃液，到達腸道；
[0013]2)所生產的幹擾素不需要純化，可以直接隨乳酸菌用於口服給藥；
[0014]3)成本低廉、易於大量生產；
[0015]4)比其它製劑具有更長的儲存期及更強的穩定性；
[0016]5)乳酸菌在腸道定殖期間還可以持續分泌幹擾素，其分泌和釋放是持續和緩和的，符合最天然的藥物代謝動力學。
【發明內容】
[0017]本發明的目的是公布一種使用食品級乳酸菌作為生產和遞送載體的，可以直接用於口服的幹擾素及其製備方法。
[0018]本發明所述的用於口服的幹擾素，其特徵在於:幹擾素的編碼基因在誘導型或者組成型啟動子的控制下，與信號肽、錨定子結合，組成完整的表達框(expressioncassette)。該表達框被插入到乳酸菌的染色體,或者質粒上來表達和分泌。
[0019]本發明所述的用於口服的幹擾素，其特徵還在於，作為表達載體的乳酸菌菌株是thyA缺失的條件致死型突變株。該突變株在人體內可以存活，但在環境中會迅速死亡，從而避免了所插入的外源基因在環境中的擴散。本發明所涉及的攜載了幹擾素表達框的重組乳酸菌是食品級的，不含外源抗生素抗性基因，可以用於口服使用。
[0020]本發明所述的用於口服的幹擾素，其特徵還在於，通過不同的表達元件，如啟動子、信號肽和錨定子的組合使用，幹擾素是被表達在乳酸菌細胞內、或者分泌到乳酸菌細胞外，或者展示在細胞壁表面的。
[0021]本發明是通過下述技術方案予以實現的:
[0022]本發明的主要技術環節包括:
[0023]將編碼成熟幹擾素(人、豬、牛、雞、犬、狐、鴨、羊、魚的成熟幹擾素蛋白)的核苷酸序列按照乳酸菌的密碼子使用偏好進行優化，與不同的啟動子(組成型或誘導型)序列、信號肽序列、錨定子序列，以及上述各序列之間的連接序列組成完整的表達框，並通過人工合成獲得；使用Cre/lox位點特異性重組系統將表達框整合到表達宿主乳酸菌菌株染色體的thyA基因位置，與thyA基因發生置換，並去除抗生素抗性基因。或者直接插入到表達質粒上，轉化乳酸菌感受態細胞，獲得重組乳酸菌。
[0024]本發明所述的乳酸菌是指衛生部頒發的《可用於食品的菌種名單》(衛辦監督發〔2010〕65號)所包含的所有乳酸菌屬所有菌株，包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、捲曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentium)、格氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius),以及乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)等。
[0025]本發明所述的幹擾素編碼序列，都根據乳酸菌的密碼子使用偏好性對核苷酸序列進行了優化，以利於在乳酸菌細胞表達。
[0026]本發明所述的經過優化後的幹擾素編碼序列，是通過市場上的核酸合成服務商進行基因合成而獲得的。
[0027]本發明所述的組成型啟動子，是一種乳桿菌rRNA啟動子的類似序列。
[0028]本發明所述的誘導型啟動子，是被食品級的誘導物或者物理條件誘導的，如Nisin，溫度、酸鹼度，等。
[0029]本發明所述的將表達框整合到表達宿主乳酸菌菌株的染色體上，並去除抗生素抗性基因，是通過Cre / IOx位點特異性重組實現的。表達框整合到染色體後，可以隨著細胞分裂而穩定遺傳，不會因外部選擇壓力的失去而丟失。
【具體實施方式】
[0030]下面結合具體實例，對本發明做進一步說明。本發明的保護範圍並不限定於下列實例。
[0031]實施例1:幹擾素編碼基因密碼子優化
[0032]由於人和動物來源的幹擾素編碼基因是真核基因，其密碼子使用偏好與乳酸菌有另IJ。為了使其能夠順利在乳酸菌細胞表達，需要對其核苷酸序列進行優化，去除稀有密碼子。 [0033]本發明所述的幹擾素，其成熟蛋白的編碼基因按照乳酸菌的密碼子使用偏好性優化後的基因序列，是如下I)或2)的核苷酸序列:
[0034]I)序列表中序列1-33所示的核苷酸序列
[0035]序列1-33所示的核苷酸序列依次為:人幹擾素d、人幹擾素β、人幹擾素Y、豬幹擾素α、豬幹擾素β、牛幹擾素α-1、牛幹擾素α _3、牛幹擾素α _7、牛幹擾素α_8、牛幹擾素β-1、牛幹擾素β _3、牛幹擾素Y、牛幹擾素Ω-1、雞幹擾素α、雞幹擾素β、犬幹擾素α -6、犬幹擾素β、犬幹擾素Y、狐狸幹擾素α、狐狸幹擾素β、狐狸幹擾素Y、鴨幹擾素α、鴨幹擾素Y、羊幹擾素α、羊幹擾素β、羊幹擾素Y、鯽魚乾擾素、鱸魚乾擾素、草魚乾擾素、大西洋鮭(三文魚)幹擾素α-1、大西洋鮭(三文魚)幹擾素α _2、斑馬魚乾擾素、金魚乾擾素；[0036]2)與序列表中序列1-33所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性核苷酸序列
[0037]實施例2:幹擾素表達框的構建
[0038]幹擾素在乳酸菌的表達與定位是通過多個表達調控元件的組合使用來實現的。這些表達調控元件包括啟動子、信號肽序列、幹擾素編碼基因、錨定子序列、以及各個表達調控元件之間的連接序列。
[0039]本發明所述的組成型啟動子，是乳桿菌rRNA啟動子的類似序列。
[0040]本發明所述的誘導型啟動子，是被食品級的誘導物或者物理條件誘導的，如Nisin，溫度、酸鹼度，等。
[0041]本發明中，啟動子序列與信號肽序列之間以CATATG，即核酸內切酶NdeI的特異性酶切位點序列連接，由此引入啟始密碼子ATG，方便基因操作。
[0042]本發明中的信號肽序列，其特徵在於，是如下I)或2)的核苷酸序列
[0043]I)序列表中序列34-41所示的核苷酸序列
[0044]2)與序列表中序列34-41所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性核苷酸序列
[0045]本發明中，信號肽序列與幹擾素編碼基因序列之間沒有多餘的連接序列。
[0046]本發明所述的用於細胞壁表面展示的錨定子序列，來自於以下蛋白質的LPXT-模序細胞壁錨定結構域(LPXTG-motif cell wall anchor domain)之一，這些蛋白質在GenBank的編碼如下:
[0047]YP_005872271、YP_005873461、CCC77736、CCC77890、CCC78260、CCC78361、CCC78381、CCC78520、CCC78612、CCC78778、CCC79729、ΥΡ_005873877、ΥΡ_005873931、ΥΡ_005873973、ΥΡ_005874035、ΥΡ_005861438 等。
[0048]以蛋白質ΥΡ_005861438為例，其錨定子的胺基酸序列為序列表中的序列42:
[0049]本發明中，幹擾素編碼基因序列與錨定子之間以GGT GGA,即兩個甘氨酸的編碼序列連接。
[0050]在本實施例中，根據不同的表達目的，表達框由不同的表達調控元件和幹擾素編碼序列組成。如果在細胞內表達，則表達框由啟動子(組成型或誘導型)序列、幹擾素編碼序列組成；如果在細胞外分泌表達，則表達框由啟動子(組成型或誘導型)序列、信號肽序列、幹擾素編碼序列組成；如果在細胞壁錨定表達，則表達框由啟動子(組成型或誘導型)序列、信號肽序列、幹擾素編碼序列和錨定子序列組成。
[0051]在本實施例中，基因(整個表達框)合成由市場上的核酸合成服務商完成，為乾粉狀DNA。合成的基因存在於核酸合成服務商提供的克隆質粒上。將DNA溶於100微升超純水備用。合成基因的N端連接一個BglII酶切位點，C端連接一個HindIII連接位點。可經BglII / HindIII雙酶切後，連接到相應的表達載體。
[0052]實施例3:幹擾素表達框插入發酵乳桿菌染色體，製備條件致死型突變株，並去除抗生素抗性基因
[0053]本實施例中所述乳桿菌特指發酵乳桿菌(Lactobacillus ferment ium)。
[0054]分兩步完成，首先將一個含有幹擾素表達框、上遊1x位點、氯黴素抗性基因、下遊1x位點的DNA片斷通過位點特異性重組插入到發酵乳桿菌染色體的thyA基因位置，替換thyA基因；然後再使用Cre酶去除抗生素抗性基因。
[0055]其中，插入片斷設計如下:來自發酵乳桿菌染色體thyA基因上遊的1000bp的DNA片斷-幹擾素表達框-1ox位點序列-氯黴素抗性基因-1ox位點序列-來自發酵乳桿菌染色體thyA基因下遊的1000bp的DNA片斷。
[0056]其中，來自發酵乳桿菌染色體thyA基因上下遊的DNA片斷，是以發酵乳桿菌基因組DNA為模板，通過PCR獲得的。以實施例2中所述的人工合成的幹擾素表達框為模板，通過PCR在兩端引入1x位點序列。3個PCR片斷首尾相繼重疊25bp，通過重疊延伸PCR連接為一個全長的DNA插入片斷。將該DNA插入片斷與pNZ質粒連接，並轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，在含有5微克/毫升氯黴素的BHI固體培養基平板上篩選陽性重組子，並進一步在含有5微克/毫升氯黴素的BHI液體培養基中擴繁，大量提取質粒DNA並測序驗證。將所提取的質粒通過電擊轉化至發酵乳桿菌，通過平行塗板篩選只在氯黴素平板而不在紅黴素平板上生長的菌落，進一步通過菌落PCR驗證，以獲得雙交換重組子。
[0057]將含有Cre重組酶編碼基因的質粒轉化上述通過驗證了的雙交換重組子(需提前製備為感受態細胞)，37°C培養子含10微克/毫升紅黴素的MRS平板，菌落出現後平行塗平板於分別含有30微克/毫升紅黴素和10微克/毫升氯黴素的培養基，篩選對氯黴素敏感但有紅黴素抗性的重組子，使用菌落PCR方法驗證氯黴素抗性基因的切除。
[0058]將該重組子37°C過夜培養於IOml不含如何抗生素的MRS培養基，以使含有Cre重組酶編碼基因的質粒丟失。將培養液塗MRS平板，37°C過夜培養，取菌落平行塗板於含有30微克/毫升紅黴素的MRS平板和不含任何抗生素的MRS平板，以篩選對紅黴素敏感的重組子，通過菌落PCR驗證含有Cre重組酶編碼基因的質粒的丟失。
【權利要求】
1.一種使用食品級乳酸菌表達和遞送的，用於直接口服的幹擾素，其特徵在於，幹擾素編碼基因序列在誘導型或者組成型啟動子的控制下，與來源於乳酸菌的信號肽序列、錨定子序列連接，組成完整的表達框，分別被整合到乳酸菌的染色體，或者插入到表達質粒上。幹擾素表達在乳酸菌細胞內、分泌到細胞外、或者錨定展示在乳酸菌細胞壁上。作為表達載體的乳酸菌菌株是缺失thyA基因的條件致死型突變株。攜載了幹擾素表達框的重組乳酸菌是食品級的，不含外源抗生素抗性基因，可以用於口服使用。
2.按照權利要求1所述的幹擾素，包括人幹擾素(α、β、gamma)、豬幹擾素(α、Β、gamma)、牛幹擾素(α、β、gamma、Ω )、雞幹擾素(α、β )、犬幹擾素(α、β、gamma )、狐幹擾素(α、β、gamma )、鴨α -幹擾素(α、gamma )、羊幹擾素(α、β、gamma )、魚(鯽魚、鱸魚、草魚、大西洋鮭、斑馬魚、金魚)幹擾素等。
3.按照權利要求2所述的幹擾索，其成熟蛋白的編碼基因按照乳酸菌的密碼子使用偏好性優化後的基因序列(人工序列)，是如下I)或2)的核苷酸序列: 1)序列表中序列1-33所示的核苷酸序列: 序列1-33所示的核苷酸序列依次為:人幹擾素α、人幹擾素β、人幹擾素Y、豬幹擾素α、豬幹擾素β、牛幹擾素α-1、牛幹擾素α _3、牛幹擾素α _7、牛幹擾素α _8、牛幹擾素β-1、牛幹擾素β _3、牛幹擾素Y、牛幹擾素Ω-1、雞幹擾素α、雞幹擾素β、犬幹擾素α _6、犬幹擾素β、犬幹擾素Y、狐狸幹擾素α、狐狸幹擾素β、狐狸幹擾素Y、鴨幹擾素α、鴨幹擾素Y、羊幹擾素α、羊幹擾素β、羊幹擾素Y、鯽魚乾擾素、鱸魚乾擾素、草魚乾擾素、大西洋鮭(三文魚)幹擾素α-1、大西洋鮭(三文魚)幹擾素α _2、斑馬魚乾擾素、金魚乾擾素； 2)與序列表中序列1-33所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性核苷酸序列。
4.按照權利要求1所述的乳酸菌菌株，包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、捲曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus) > 保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentium)、格氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)、副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius),以及乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)等。
5.按照權利要求1所述的完整表達框，其特徵在於包括組成型或誘導型啟動子序列、來源於乳酸菌的信號肽序列、幹擾素編碼基因序列、錨定子序列，以及它們之間的連接片斷組成。表達框位於表達載體乳酸菌的染色體或者質粒上。
6.按照權利要求1所述的乳酸菌thyA基因缺失突變株，其特徵在於，是利用Cre/ 1x位點特異性重組系統，使幹擾素表達框與thyA基因發生置換而獲得的；或者是利用Cre /1x位點特異性重組系統將thyA基因敲除而獲得的。
7.按照權利要求5所述的信號肽序列，其特徵在於，是如下I)或2)的核苷酸序列: 1)序列表中序列34-41所示的核苷酸序列 2)與序列表中序列34-41所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性核苷酸序列。
8.按照權利要求5所述的錨定子序列，其特徵在於，是來自於以下蛋白質的LPXT-模序細胞壁錨定結構域(LPXTG-moti fee 11 wall anchor domain)之一，這些蛋白質在GenBank的編碼如下:
YP_005872271、YP_00587346U CCC77736、CCC77890、CCC78260、CCC78361、CCC78381、CCC78520、CCC78612、CCC78778、CCC79729、YP_005873877、YP_00587393U YP_005873973、YP_005874035、YP_005861438 等。
【文檔編號】C12R1/23GK103834678SQ201210491070
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月23日 優先權日:2012年11月23日
【發明者】劉佔良 申請人:劉佔良