一種青花菜小孢子再生植株的培養方法
2023-08-02 08:17:26
專利名稱：一種青花菜小孢子再生植株的培養方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養技術領域，尤其涉及一種青花菜小孢子再生植株的培養方法。
背景技術：
青花菜(B rassica oleracea L var. italica)又名西蘭花、綠菜花、莖椰菜等， 是十字花科蕓薹屬甘藍種中以綠色花球為產品器官的一、二生草本植物，其以主莖及側枝頂端形成的綠色花球為產品，營養豐富，色、香、味具佳，是國際市場十分暢銷的一種名特蔬菜。目前，我國青花菜主栽品種大部分都來自國外，具有我們自主智慧財產權的品種匱乏，究其原因是因為我們自己的青花菜育種資源很少，配製不出好的材料，因此迫切需要通過育種的手段，把市場上應用的品種進行多年自交分離。傳統的多代自交分離的方法一般需要 5 6年的時間才能選育到一個純合的親本材料，但其表現是否優良、能否與其它材料組配，以及配製出來的雜交種表現能否得到育種家們的認可還不得而知，這又需要6 8年的時間。小孢子培養方法可以在1 2年內快速獲得雙單倍體純系，比傳統的方法縮短了 3 4年的時間，從而大大縮短了育種進程，提高了育種的效率。自1982年Lichter首次報導油菜游離小孢子培養獲得再生植株以來，蕓薹屬作物，尤其是油菜的小孢子培養，無論是在出胚率、出胚量，還是胚培養及再生植株方面都獲得了很大的成功。相對於甘藍型油菜、結球甘藍等作物，青花菜游離小孢子的培養難度較大。國外研究最早見於1991年Takahata等人的報導，國內則是張德雙等於1997年在巴綠青花菜等品種的研究上獲得成功。隨後，張延國等(中國蔬菜，2005(6) :7 9)、方淑桂等(福建農林大學學報(自然科學版)，2005，34(1) :51 55)、袁素霞(中國農業科學， 2009,42(1) :189 197)等人也有報導，但青花菜小孢子胚胎發生的效率普遍不高，對難出胚的品種來說，效果很不理想。申請號為200910101722. 5的中國發明專利申請中公開了一種青花菜高二倍體率小孢子再生植株的培養方法，主要涉及改變常規培養基成分和培養方法，以提高青花菜植株的二倍體率。有關蕓薹屬游離小孢子培養的大量研究表明，供體植株的基因型對小孢子胚胎發生的影響極為重要，它不僅影響產胚率，而且也影響胚的質量 (Chuong et al.，1988)，抑制了小孢子培養育種技術的應用。因此，尋找一種提高青花菜出胚率的方法具有重要的意義。
發明內容
本發明提供了一種青花菜小孢子再生植株的培養方法，採用高出胚率的油菜品種和低出胚率的青花菜品種混合培養，得到低出胚率的青花菜小孢子苗，提高青花菜小孢子培養出胚率。一種青花菜小孢子再生植株的培養方法，包括以下步驟1)取青花菜的花序和油菜的花序作為小孢子培養的供體植株；直接或將花序誘導後取花蕾，得到油菜和青花菜混合花蕾；
2)將滅菌後的油菜和青花菜混合花蕾中加入NLN-13誘導培養基，研磨成懸浮液， 過濾所得濾液經離心、棄上清液得到沉澱，依次加入NLN-13誘導培養基和活性炭混合液， 得到小孢子混合懸浮液；3)將小孢子懸浮液在黑暗條件下於32°C 33°C恆溫熱激處理1天 3天，後取出在黑暗條件下於25士2°C培養20天 30天，得到子葉期胚狀體；4)將子葉期胚狀體接種至胚狀體分化培養基中培養至形成胚狀體；將胚狀體接種到胚狀體分化培養基中繼續培養，直至分化，再生成芽；5)切取再生芽接種至生根培養基上培養，將根生長健壯的苗經煉苗和移栽，得到再生植株，鑑定。為了達到更好的效果，優選所述的花蕾為花序上花瓣和花葯長度比為0. 7 1. 2、單核晚期至雙核早期的花
O誘導後的花蕾也更利於小孢子的培養，所述的誘導的條件為在；TC 6°C誘導 0. 1小時 48小時。所述的油菜和青花菜混合花蕾中油菜花蕾與青花菜花蕾的用量一般不做特別的限定，為了達到更好的效果，進一步優選油菜花蕾的數量略大於青花菜花蕾的數量。步驟2、中，所述的滅菌採用本領域常規的滅菌方法，可採用滅菌液將油菜和青花菜混合花蕾滅菌15 20分鐘，清洗乾淨後得到滅菌後的油菜和青花菜混合花蕾。一般用於外植體滅菌的滅菌液有升汞溶液、次氯酸鈉溶液等，由於升汞溶液有很大的毒性，且汙染環境，對人體有害；而次氯酸鈉滅菌的效果較好，沒有毒害，所述的滅菌液優選次氯酸鈉溶液。以IL次氯酸鈉溶液計，組成為質量百分濃度為5. 6%的次氯酸鈉水溶液56ml、無水乙醇100ml、洗潔精8滴 10滴和餘量的無菌水。所述的NLN-13誘導培養基為由NLN液體培養基IL和蔗糖130g組成，pH 6. 0 6. 2 ；高溫高溼滅菌，備用。所述的活性炭混合液的組成為NLN液體培養基1L、瓊脂糖2g_5g和Ig活性炭；高溫滅菌，備用。所述的NLN 液體培養基，以 IL 計，組成為KN03125mg，Ca (NO3) 2 · 4H20 500mg, MgSO4 · 7H20 125mg, KH2PO4125mg, H3B036. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg，維生素 BIO. 5mg，維生素 B60. 5mg,生物素 0. 05mg,葉酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H2027. 8mg，肌醇 lOOmg， 甘氨酸ang，煙酸5mg，L-穀氨醯胺800mg，穀胱甘肽30mg，維生素B55mg，絲氨酸IOOmg和餘量的無菌水。所述的沉澱可以重複以下操作1 2次在沉澱中加入NLN-13誘導培養基，研磨成懸浮液，過濾所得濾液經離心、棄上清液。重複操作後所得的沉澱中依次加入NLN-13誘導培養基和活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液。所述的小孢子混合懸浮液中小孢子的濃度為0. 8X IO5個/mL 1. 2X IO5個/mL。所述的過濾可採用45 μ m無菌濾網。所述的離心的條件一般為600rpm/min 900rpm/min離心3min 5min。步驟3)中，在黑暗條件下於25士2°C培養20天 30天的具體步驟為在黑暗條件下於25士2°C培養至肉眼可見胚狀體時，再在黑暗條件下於25士2°C條件下搖動培養；搖動培養相對於不搖動培養的小孢子胚生長的較健壯。步驟4)中，所述的培養條件為每天12小時 18小時光照和20°C 下培養；進一步優選為每天16小時光照和25°C下培養。一般培養時間為2周 3周。所述的胚狀體較大時可切成多塊後接種。所述的胚狀體分化培養基為由MS培養基1L、蔗糖20g和瓊脂IOg 12g組成， pH5. 8 6. 1 ；高溫高溼滅菌。步驟5)中，所述的生根培養基為由MS培養基1L、糖20g 30g和瓊脂6g 7g 組成，pH5. 6 6. 0 ；所述的糖為蔗糖或白糖；高溫高溼滅菌。所述的MS 培養基，以 IL 計，組成為:NH4H031650mg, KN031900mg, CaCl2 · 2H20 440mg, KH2PO4170mg, MgSO4 · 7H20 370mg, FeSO4 · 7H2027. 8mg, Na2EDTA 37. 3mg, H3B036 . 2mg, MnSO4 · H2O 16. 9mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, KI 0. 83mg,肌醇 IOOmg,甘氨酸 2mg,煙酸 0. 5mg,維生素 BIO. lmg,維生素B60. 5mg和餘量的無菌水。移栽時用清水洗淨組培苗根部培養基，用質量百分濃度為75% 80%的百菌清 (如市售的百菌清可溼性粉劑)800 1000倍(稀釋的倍數)液浸泡組培苗根部1 2分鐘後植於青花菜育苗專用基質穴盤，塑料膜罩住保溼，在溫室中培養15 20天後移栽。通過百菌清來殺菌，並給予一定的緩衝環境，以更好的使在生長環境較好的實驗室裡生長的組培苗適應較嚴酷的自然環境。所述的鑑定可採用本領域常用的倍性鑑定方法，如取再生植株的嫩葉檢測各再生植株倍性，並從再生植株群體中鑑定出油菜再生苗和青花菜再生苗。可用美國BD公司的BD FACSCalibur流式細胞儀進行倍性分析和再生植株種類的鑑定。本發明的有益效果為1、本發明針對現有青花菜小孢子培養出胚率低，尤其是非常難以出胚的品種，提供了一種提高出胚率的方法，採用易出胚的油菜品種和難出胚的青花菜花蕾混合培養的方法，以易出胚的材料帶動難出胚的材料出胚，提高青花菜的出胚率。本發明方法混合培養青花菜出胚率最高達138個/蕾，而對照青花菜出胚率最高僅為2個/蕾，解決了青花菜小孢子培養胚胎發生頻率較低的問題，提高了小孢子培養技術的利用效率。2、經肉眼觀察及流式細胞儀檢測發現，在相同的條件下混合培養最後得到14株青花菜小孢子苗，而青花菜花蕾單獨培養的對照株數為0株。
具體實施例方式實施例1培養方法按如下步驟進行。(1)培養基配製包括小孢子不同培養階段的培養基，其組分與各組分在每升培養基中所含的重量為表INLN和MS培養基配方表
權利要求
1.一種青花菜小孢子再生植株的培養方法，包括以下步驟1)取青花菜的花序和油菜的花序作為小孢子培養的供體植株；直接或將花序誘導後取花蕾，得到油菜和青花菜混合花蕾；2)將滅菌後的油菜和青花菜混合花蕾中加入NLN-13誘導培養基，研磨成懸浮液，過濾所得濾液經離心、棄上清液得到沉澱，依次加入NLN-13誘導培養基和活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液；3)將小孢子懸浮液在黑暗條件下於32°C 33°C恆溫熱激處理1天 3天，後取出在黑暗條件下於25士2°C培養20天 30天，得到子葉期胚狀體；4)將子葉期胚狀體接種至胚狀體分化培養基中培養至形成胚狀體；將胚狀體接種到胚狀體分化培養基中繼續培養，直至分化，再生成芽；5)切取再生芽接種至生根培養基上培養，將根生長健壯的苗經煉苗和移栽，得到再生植株，鑑定。
2.根據權利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培養方法，其特徵在於，步驟1)中， 所述的花蕾為花序上花瓣和花葯長度比為0. 7 1. 2、單核晚期至雙核早期的花蕾。
3.根據權利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培養方法，其特徵在於，步驟1)中， 所述的誘導的條件為在3°C 6°C誘導0. 1小時 48小時。
4.根據權利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培養方法，其特徵在於，步驟2)中， 所述的NLN-13誘導培養基為由NLN液體培養基IL和蔗糖130g組成，pH 6. 0 6. 2 ；所述的活性炭混合液的組成為NLN液體培養基1L、瓊脂糖2g-5g和Ig活性炭；所述的NLN液體培養基，以IL計，組成為KN03125mg，Ca(NO3)2 · 4H20 500mg, MgSO4 · 7H20 125mg, KH2PO4125mg, H3B036. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg，維生素 BIO. 5mg，維生素 B60. 5mg,生物素 0. 05mg,葉酸 0. 5mg, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H2027. 8mg，肌醇 lOOmg， 甘氨酸ang，煙酸5mg，L-穀氨醯胺800mg，穀胱甘肽30mg，維生素B55mg，絲氨酸IOOmg和餘量的無菌水。
5.根據權利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培養方法，其特徵在於，步驟2)中， 所述的沉澱重複以下操作1 2次在沉澱中加入NLN-13誘導培養基，研磨成懸浮液，過濾所得濾液經離心、棄上清液。
6.根據權利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培養方法，其特徵在於，步驟2)中， 所述的小孢子混合懸浮液中小孢子的濃度為0. 8X IO5個/mL 1. 2X IO5個/mL。
7.根據權利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培養方法，其特徵在於，步驟3)中， 在黑暗條件下於25 士 2°C培養20天 30天的具體步驟為在黑暗條件下於25 士 2°C培養至肉眼可見胚狀體時，再在黑暗條件下於25士2°C條件下搖動培養。
8.根據權利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培養方法，其特徵在於，步驟4)中， 所述的培養條件為每天12小時 18小時光照和20°C 下培養。
9.根據權利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培養方法，其特徵在於，步驟4)中， 所述的胚狀體分化培養基為由MS培養基1L、蔗糖20g和瓊脂IOg 12g組成，pH5. 8 6. 1。
10.根據權利要求1所述的青花菜小孢子再生植株的培養方法，其特徵在於，步驟5)中，所述的生根培養基為由MS培養基1L、糖20g 30g和瓊脂6g 7g組成，pH5. 6 6.0;所述的糖為蔗糖或白糖。
全文摘要
本發明公開了一種青花菜小孢子再生植株的培養方法，包括取青花菜和油菜的花序，直接或誘導後取花序上的花蕾，滅菌後加入NLN-13誘導培養基，製成懸浮液，過濾所得濾液經離心得到沉澱；依次加入NLN-13誘導培養基和活性炭混合液，得到小孢子懸浮液；經熱激處理後培養，得到子葉期胚狀體；接種至胚狀體分化培養基中直至分化，再生成芽；切取再生芽接種至生根培養基上生根培養，經煉苗和移栽，得到再生植株；取再生植株的嫩葉檢測各再生植株倍性，並從再生植株群體中鑑定出油菜再生苗和青花菜再生苗。該方法將易出胚的油菜與難出胚的青花菜品種混合培養，以易出胚的材料帶動難出胚的材料出胚，提高青花菜的出胚率。
文檔編號A01H4/00GK102239803SQ20111011253
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月3日 優先權日2011年5月3日
發明者周偉軍, 莊義慶, 張振超, 耿鑫鑫, 許玲 申請人:江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所, 浙江大學