一種用於hplc檢測的水稻種胚中寡糖的提取方法
2023-07-24 02:03:16
一種用於hplc檢測的水稻種胚中寡糖的提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於HPLC檢測的水稻種胚中寡糖的提取方法，包括：取種胚，研磨後加入濃度為75～85％的乙醇溶液進行振蕩提取，振蕩提取結束後離心，得第一上清液和殘渣；向所述的殘渣中加入濃度為75～85％的乙醇溶液進行超聲提取，超聲提取結束後，離心，得第二上清液；合併所述的第一上清液和第二上清液，濃縮乾燥。本發明需要樣品少，損耗溶劑少，提取速度快，提高了檢測效率。
【專利說明】一種用於HPLC檢測的水稻種胚中寡糖的提取方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於分析化學【技術領域】，尤其涉及一種用於HPLC檢測的水稻種胚中寡糖 的提取方法。
【背景技術】
[0002] 遇連綿陰雨或者高溫高溼天氣，雜交水稻種子會出現含水量過高，甚至穗發芽現 象，穗發芽極大降低種子質量，含水量過高將增加種子加工的成本。因此在種子成熟後期合 理適度的脫水是必要的。
[0003] 脫水耐性強的種子和不耐脫水種子所含糖的種類和數量差別很大，而且脫水耐性 的變化與發育階段和成熟程度存在顯著的相關性。糖含量的多寡同脫水細胞的玻璃化進程 相關，因此研究種子脫水耐性，需要對寡糖進行仔細的研究。
[0004] 長期以來對寡糖的檢測方法有：薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法。薄層 色譜法具有成本低、速度快、展開時間短的優點，但同氣相色譜和液相色譜比，具有測量誤 差較大、不易進行定量分析的缺點。氣相色譜具有高效、高速、高靈敏度和樣品用量少的優 點，但進樣口的高溫有時會使糖的衍生物分解、甚至被進樣口殘留物催化。高效液相色譜因 為重現性好、檢測限低、分離效果好等優點被廣泛應用。而好的樣品預處理方法是成功利用 HPLC分析待測物的關鍵環節。
[0005] 當前用於種子寡糖前處理的方法較為複雜，如VINEET KUMAR等（VINEET KUMAR, ANITARANI, et al. Sucrose and Raffinose Family Oligosaccharides(RFOs)in Soybean Seeds As Influenced by Genotype and Growing Location. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 5081 - 5085)在提取大豆種子中的寡糖時，需先將大豆種子在己烷中處理3 小時，處理後的種子在80%的乙醇中水浴浸提4小時，提取液用醋酸鉛純化兩次，最後得到 的上清液經濃縮過濾後進行HPLC檢測。該種提取方法所需時間長，且提取過程中用到己 烷、醋酸鉛等大量的有毒試劑，另外，大豆種子與水稻種子的成分差異很大。因此，提供一種 快速、經濟環保的水稻種子寡糖提取方法顯得十分必要。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種用於HPLC檢測的水稻種胚中寡糖的提取方法，適用於樣品量 較少的情況，快速、準確、環保。
[0007] -種用於HPLC檢測的水稻種胚中寡糖的提取方法，包括：
[0008] (1)取種胚，研磨後加入濃度為75?85%的乙醇溶液進行振蕩提取，振蕩提取結 束後離心，得第一上清液和殘渣；
[0009] (2)向所述的殘渣中加入濃度為75?85%的乙醇溶液進行超聲提取，超聲提取結 束後，離心，得第二上清液；
[0010] (3)合併所述的第一上清液和第二上清液，濃縮乾燥。
[0011] 本發明提取水稻種胚中的寡糖時，先用乙醇溶液進行振蕩提取，然後再採用超聲 進一步提取，能夠儘可能多的提取出水稻種胚中的寡糖，保證檢測的準確性，且振蕩提取和 超聲提取相配合，能夠大大的縮短提取時間，且所需的樣品量少，同時也能夠滿足HPLC檢 測的樣品要求。本發明所述的寡糖為蔗糖、棉子糖、果糖和葡萄糖中的一種或幾種。
[0012] 適宜的固液比有利於種胚中寡糖的提取，優選的，所述振蕩提取時，固液比（或料 液比）為1 :1〇〇?200,更優選為1 :150。優選的，所述超聲提取時，固液比為1 :50?100， 更優選為1 :100。
[0013] 本領域人員可以理解，固液比為種胚的質量（g)與乙醇溶液的體積（ml)之比。
[0014] 提取溫度和時間也會影響種胚中寡糖的釋放，從而影響提取效果，溫度過低，分子 運動慢，寡糖釋放慢，溫度過高則容易導致寡糖發生降解，另外，時間過短則不能完全的將 寡糖提取出來，而時間過長則會使雜質浸出量增加，增加對後續HPLC檢測的幹擾。
[0015] 優選的，所述振蕩提取的溫度為75?85°C，時間為25?35min。更優選的，所述 振蕩提取的溫度為80°C，時間為30min。
[0016] 優選的，所述超聲提取的溫度為15?25°C，時間為25?35min。更優選的，所述 超聲提取的溫度為20°C，時間為30min。超聲提取時，超聲功率一般為50?100W。
[0017] 合併的第一上清液和第二上清液即為含寡糖的溶液，通常需要濃縮乾燥，以利於 定容進行HPLC分析，所述濃縮乾燥的方法為氮氣吹乾。氮氣吹乾適用於本發明樣品量較少 的溶液乾燥，避免寡糖在乾燥過程中發生較大的損失。所述氮氣吹乾的溫度為35?45°C。
[0018] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0019] 本發明採用振蕩提取和超聲提取相結合的方式，所需樣品少。不使用汙染性的有 機溶劑，在降低成本的同時也更加環保。更重要的是，本發明可大大節省提取時間。
[0020] 本發明的提取方法可靠，可同時準確的提取分子量大小不同的蔗糖、棉子糖、果糖 和葡萄糖四種寡糖，能夠滿足高效液相色譜對樣品處理的要求。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合【具體實施方式】進一步闡釋本發明。
[0022] 本發明所用儀器包括：氮吹儀，超聲振蕩儀、恆溫水浴震蕩器、高速離心機。
[0023] 對比例1
[0024] (1)第一次提取上清液：取授粉後22天採收的水稻新鮮種胚10粒，與80%乙醇溶 液混合研磨，固液比（水稻種胚質量g :乙醇溶液體積ml)為1 :150 ;研磨後，將混合液置於 80°C恆溫水浴震蕩器中振蕩提取30min，然後16000r/min離心15min，得到第一次提取上清 液和固體殘渣；
[0025] (2)第二次提取上清液：將第一次提取後的固定殘渣與80%乙醇溶液混合均勻， 固液比為1 :100,80°C振蕩提取30min後16000r/min離心15min，得到第二次提取上清液和 固體殘渣；
[0026] (3)第三次提取上清液：將第二次提取後的固定殘渣與80%乙醇溶液混合均勻， 固液比為1 :50,80°C振蕩提取30min後16000r/min離心15min，得到第三次提取上清液和 固體殘渣；
[0027] (4)合併三次提取的上清液，室溫下氮氣吹乾後，得寡糖粉末；
[0028] (5)向寡糖粉末中加入超純水溶解，0. 45 μ m濾膜過濾後用HPLC法測定寡糖（蔗 糖、棉子糖、果糖、葡萄糖）的含量。
[0029] 色譜條件：WATERS2410示差折光檢測器檢測，Xtimate Sugar-Ca色譜柱，流動相 為去離子水，柱溫80°C，流速0. 5ml/min，進樣體積為50μ 1。
[0030] 採用多次乙醇溶液提取的方法，整個寡糖的提取過程需要5. 0小時，HPLC測定結 果顯示，該提取方法測得水稻種胚中蔗糖含量為14. 920 μ g/粒，棉子糖為2. 739 μ g/粒， 果糖為0. 780 μ g/粒，葡萄糖為0. 312 μ g/粒。若將第一次提取液直接氮氣吹乾後，溶解 過濾檢測，測得水稻種胚中蔗糖含量為12. 681 μ g/粒，棉子糖為2. 314 μ g/粒，果糖為 0. 487 μ g/粒，葡萄糖為0. 253 μ g/粒，說明雖然僅經過一次提取能夠縮短提取時間，但是 提取的寡糖量少，不能夠準確反映水稻種子中的寡糖含量。
[0031] 實施例1
[0032] (1)取10粒授粉後22天採收的水稻新鮮種胚，稱重後常溫下研磨成粉末狀，力口 80%乙醇溶液lml (固液比為1 :150)研磨均勻，然後置於80°C恆溫振蕩水浴鍋中振蕩提取 30min。振蕩提取結束後，將混合物放至常溫後，16000r/min離心15min，得第一次提取上清 液和固體殘渣。
[0033] (2)向第一次提取後的固體殘渣中加80%乙醇溶液0. 5ml (固液比為1 :100)，混 合均勻後置於超聲振蕩儀中萃取30min，超聲功率為80W，超聲萃取結束後，16000r/min離 心15min，得第二次提取上清液。
[0034] (3)合併兩次提取上清液，室溫下氮氣吹乾（約兩個小時），得寡糖粉末。
[0035] (4)向寡糖粉末中加去離子水定容至100 μ 1，0. 45 μ m濾膜過濾後用HPLC法測定 寡糖（蔗糖、棉子糖、果糖、葡萄糖）的含量。
[0036] 步驟（2)中，超聲波溫度設了 10°C、2(TC和45°C共3個水平分別進行提取。
[0037] 色譜條件：WATERS2410示差折光檢測器檢測，Xtimate Sugar-Ca色譜柱，流動相 為去離子水，柱溫80°C，流速0. 5ml/min，進樣體積為50μ 1。
[0038] 結果如表1所示，超聲溫度為20°C對寡糖的提取效果較好，提取出的寡糖含量與 實施例1結果無顯著差異，但是提取時間大大縮短，用時縮短約3小時。
[0039] 表1超聲溫度對水稻種胚寡糖提取的影響
[0040]
【權利要求】
1. 一種用於HPLC檢測的水稻種胚中寡糖的提取方法，其特徵在於，包括： (1) 取種胚，研磨後加入濃度為75?85%的乙醇溶液進行振蕩提取，振蕩提取結束後 離心，得第一上清液和殘渣； (2) 向所述的殘渣中加入濃度為75?85%的乙醇溶液進行超聲提取，超聲提取結束 後，離心，得第二上清液； (3) 合併所述的第一上清液和第二上清液，濃縮乾燥。
2. 如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，所述振蕩提取時，固液比為1 :100? 200。
3. 如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，所述振蕩提取的溫度為75?85°C，時 間為25?35min。
4. 如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，所述超聲提取時，固液比為1 :50? 100。
5. 如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，所述超聲提取的溫度為15?25°C，時 間為25?35min。
6. 如權利1所述的提取方法，其特徵在於，所述濃縮乾燥的方法為氮氣吹乾。
7. 如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，所述氮氣吹乾的溫度為35?45°C。
8. 如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，所述的寡糖為蔗糖、棉子糖、果糖和葡 萄糖中的一種或幾種。
【文檔編號】G01N30/02GK104090049SQ201410320770
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月7日 優先權日:2014年7月7日
【發明者】胡晉, 朱麗偉, 關亞靜, 王齊天, 胡琦娟, 胡偉民 申請人:浙江大學