用於治療鼻咽癌的Bc1－2基因的反義核苷酸製劑及其應用的製作方法

2023-07-24 02:45:06

專利名稱：用於治療鼻咽癌的Bc1－2基因的反義核苷酸製劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種Bcl-2基因的反義核苷酸製劑，具體地說涉及用於治療鼻咽癌的Bcl-2基因的反義核苷酸製劑。
本發明還涉及Bcl-2基因的反義核苷酸製劑在治療鼻咽癌中的應用。
Bcl-2基因被發現是廣泛存在於惡性腫瘤細胞中的一種癌基因，其表達與惡性腫瘤的發生、發展具有密切的聯繫。在NPC組織中，Bcl-2基因和Bcl-2表達的蛋白質的兩個斷點已經通過在雜交和免疫化學技術分析清楚。大多數NPC病例表達Bcl-2蛋白質，陽性率接近83％。Bcl-2基因蛋白質的表達在鼻咽的上皮進行，並產生致癌作用，誘導鼻咽癌的發生。
反義核苷酸技術是近年來得到迅速發展的能有效抑制腫瘤細胞基因表達的分子生物學技術，它是根據鹼基互補原理，用人工合成或生物合成的的針對目的基因的特定互補的DNA或RNA序列，導入靶細胞，形成mRNA-DNA或mRNA-RNA雜交雙鏈，從而抑制或封閉目的基因的表達，使其喪失活性，達到基因控制和治療的目的。反義核苷酸的安全性高，不存在外源性DNA整合到靶細胞DNA的問題，而且設計方便，序列短、易於合成，反義核苷酸還具有劑量調節效應。經過多年的基礎研究，伴隨著先進的基因克隆和基因測序技術的出現，以及DNA合成技術的迅速發展，針對癌基因、生長因子及其受體、信號傳導通路等設計的反義核苷酸藥物可調控基因表達或抑制一些有害基因或失控基因的過度表達，有希望成為分子水平治療各種疾病如愛滋病、癌症、病毒感染、高血壓、慢性感染疾病和遺傳病等的新的突破口，正日益受到世界範圍內的廣泛重視。
目前，現有技術中尚沒有治療鼻咽癌的反義核苷酸酸製劑。
根據本發明的一方面，提供一種具有SEQ ID NO.1的反義核苷酸序列，它可以與Bcl-2基因開放閱讀框(open reading frame)mRNA的前6個密碼子形成DNA/RNA雙鏈體，而抑制Bcl-2 mRNA的表達，Bcl-2 mRNA隨後被水解。
根據本發明的另一方面，提供一種治療鼻咽癌的反義核苷酸製劑，其含有SEQ ID NO.1的核苷酸，並且添加藥學上可接受的載體或賦形劑或可選的其它成分，而製成反義核苷酸製劑。
根據本發明的又一方面，本發明的反義核苷酸製劑的劑量形式可以包括適於靜脈注射或皮下注射的針劑以及適於局部給藥的乳劑、懸浮劑、溶液以及其他適當的製劑形式。
根據本發明的再一方面，提供Bcl-2基因的反義核苷酸製劑在治療人鼻咽癌中的應用。通過靜脈、皮下或局部給予鼻咽癌患者以治療有效量的本發明Bcl-2反義核苷酸製劑而有效地治療鼻咽癌。本發明的反義核苷酸製劑通常可以與放療或化療聯合應用來治療鼻咽癌。
本發明的Bcl-2基因的反義核苷酸可以與鼻咽癌細胞中的Bcl-2基因的mRNA雜交形成mRNA-DNA，抑制Bcl-2基因在NPC細胞中的表達，在臨床治療中，結合輻射和化療來誘導NPC細胞凋亡，並經過放大而有效地治療鼻咽癌。應用本發明的Bcl-2基因的反義核苷酸來治療鼻咽癌最終將增加輻射治療的功效，減少毒副影響。
發明的
具體實施例方式
針對Bcl-2基因的核苷酸序列設計了SEQ ID NO.1的反義核苷酸序列，該反義序列是由18個核苷酸所構成的短鏈寡聚脫氧核糖核酸。該18-mer全磷酸反義寡核苷酸與Bcl-2基因開放閱讀框mRNA的前6個密碼子形成一個DNA/RNA雙鏈體，使Bcl-2mRNA不能表達，mRNA隨後被酶水解。
實施例1 Bcl-2基因反義核苷酸G51的人工合成寡聚核苷酸G51是用標準DNA合成儀合成，合成的寡核苷酸在氨水60℃保存4小時。將產物重新溶於水，用HPLC強離子交換樹脂和鹽析進行純化，經分光光度計檢查和聚丙烯醯胺凝膠電泳，測得其純度為99％。
實施例2G51注射溶液的製備對於靜脈注射和皮下注射的G51注射溶液可以用PBS溶液來製備。通過測定合成的反義核苷酸在260nm的光密度值而定量G51寡聚核苷酸的濃度，將需要濃度的G51與PBS在37℃保溫4小時，即製得G51注射溶液。
實施例3G51反義核苷酸用於臨床治療鼻咽癌Bcl-2基因用於治療鼻咽癌，我們得出的5年存活率局部控制為86.4％，疾病消除存活為84.7％，保險存活為88.5％，完全存活為84.2％。其次，對於低於40歲和那些接受了頸部電子束照射的病人有更好的疾病控制。多因素分析顯示，一旦治療組進入模型，年齡的預測功能將更加重要。在局部復發消除存活、疾病消除存活和保險存活方面，女性似乎有更好的5年存活率。
以上對本發明較佳實施方式的描述並不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變和變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬於本發明的範圍。
SEQUENCE LISTING110深圳市生爾易實業發展有限公司120用於治療鼻咽癌的bcl-2基因的反義核苷酸製劑及其應用130PI019251601170PatentIn version 3.1210121118212DNA213人工序列220221反義核苷酸222(1)..(18)2234001tctcccagcg tgcgccat 18
權利要求
1.一種治療鼻咽癌的反義核苷酸製劑，其特徵在於它含有SEQ IDNO.1序列的反義核苷酸。
2.根據權利要求1所述的反義核苷酸製劑，其特徵在於它進一步包含藥學上可接受的載體、賦形劑或可選的其它成分。
3.根據權利要求2所述的反義核苷酸製劑，其特徵在於將人工合成的所述具有SEQ ID NO.1序列的反義核苷酸溶於PBS溶液製得注射劑。
4.一種含有Bcl-2基因反義核苷酸的反義核苷酸製劑在治療鼻咽癌中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其中所述反義核苷酸製劑與放射治療聯合應用治療鼻咽癌。
6.根據權利要求4所述的應用，其中所述反義核苷酸製劑與化學治療聯合應用治療鼻咽癌。
7.根據權利要求4所述的應用，其中所述反義核苷酸製劑通過靜脈或皮下給藥治療鼻咽癌。
8.根據權利要求4所述的應用，其中所述反義核苷酸製劑通過局部給藥治療鼻咽癌。
全文摘要
本發明提供一種具有SEQ ID NO.1序列的反義核苷酸製劑，它針對Bcl－2基因設計，採用人工合成，添加藥學上可接受的載體、賦形劑或可選的其它成分，可有效地抑制鼻咽癌細胞中Bcl－2基因的表達。本發明的反義核苷酸製劑可單獨或與放、化療聯合應用治療鼻咽癌。
文檔編號A61P35/00GK1418639SQ01134680
公開日2003年5月21日 申請日期2001年11月12日 優先權日2001年11月12日
發明者楊大俊, 周向陽, 周國慶 申請人:深圳市生爾易實業發展有限責任公司