一種食品中沙門菌的pcr檢測方法

2023-07-18 15:56:01 2

一種食品中沙門菌的pcr檢測方法
【專利摘要】本發明具體為一種食品中沙門菌的PCR檢測方法。該檢測方法包括以下步驟：（1）樣品預處理：取樣後加入無菌生理鹽水溶解；（2）細菌培養：先進行前增菌再進行選擇性增菌，並進行細菌鑑定，取鑑定後的菌落加入無菌生理鹽水配製成菌懸液；（3）DNA提取：取菌懸液離心，沉澱洗滌，煮沸，懸浮菌體，冷卻加入Tris-HCL緩衝液，離心，取上清作為模板；（4）PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟（3）中的模板進行PCR擴增得PCR擴增產物；（5）PCR產物檢測：取擴增產物，進行凝膠電泳成像。該檢測方法可迅速檢出食品中沙門菌，檢測結果準確，敏感度及特異度高。
【專利說明】-種食品中沙門菌的PCR檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬食品安全檢測領域，具體涉及食品中沙門菌的快速檢測方法。

【背景技術】
[0002] 沙門菌廣泛存在於自然界，是引起食源性疾病的首要病原菌，人與動物均可感染， 人類感染沙門菌後可發生傷寒、副傷寒、胃腸炎等疾病，傷寒傳染性強、病程長，患者需住院 隔離治療，是我國《傳染病防治法》中規定報導的乙類傳染病。近年來，隨著臨床抗生素的 不合理應用，且病原菌耐藥性的產生及變異增加，傷害早期診斷較困難，因此，有必要開發 靈敏的病原菌的早期檢測方法。
[0003] 目前，公共衛生、食品安全及出入境檢驗檢疫中均將沙門菌檢測作為常規必需檢 測的項目。經典的檢測方法為血培養，陽性率可達60% -80%，但該檢測方法耗時長，約 3-5d，且檢出率受採血量及服用抗生素等多種因素影響，此外，分離培養也較困難，因此，準 確性及特異性均較差。近年來，有文獻報導採用PCR方法檢測食品中沙門菌，但這些方法大 多側重於單一 PCR，而食品中沙門菌含量往往極低，傳統的PCR檢測則顯示出明顯缺陷。為 此，本發明提供一種特異性強靈敏度高的多重PCR檢測方法。


【發明內容】

[0004] 本發明針對上述現有技術的不足，提供一種食品中沙門菌的快速檢測方法，檢測 結果準確，特異性及靈敏度均較高。
[0005] 本發明的技術方案如下：
[0006] -種食品中沙門菌的PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0007] (1)樣品預處理：準確稱取固體樣品2_5g，粉碎，或量取液體樣品5-10ml，在粉碎 後的固體樣品及液體樣品中加入無菌生理鹽水進一步溶解；
[0008] (2)細菌培養：將待測樣品置入培養基中培養4_6h，取2_5g培養後紅色可疑菌落， 繼續培養4_6h，將培養後的產物進行細菌鑑定，取鑑定後的菌落加入無菌生理鹽水配製成 菌懸液；
[0009] (3) DNA提取：取步驟⑵中的菌懸液5-10ml，離心5-8min，沉澱洗漆，煮沸 5-8min，加入NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入Tris-HCL緩衝液，離心，取上清l-3ul作為模 板；
[0010] (4)PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟（3)中的模板進行PCR擴增；
[0011] 反應體系：10XPCR buffer 緩衝液 2. 5-5ul，Mg2+試劑 5-10ul，PCR 引物 5-10ul， Taq DNA聚合酶2_5ul，加純化水補足至25ul ;
[0012] 反應過程：95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進行30 個循環；最後72 °C延伸5min，得PCR擴增產物；
[0013] (5) PCR產物檢測：取步驟（4)中反應得到的PCR擴增產物5-10ul，分別進行凝膠 電泳成像。
[0014] 優選的，所述的培養基為加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增養基。
[0015] 優選的，所述的沉澱洗滌均採用PBS緩衝液，所述的沉澱洗滌重複操作2-5次。
[0016] 優選的，所述的NaOH溶液濃度為2-5mol/L，所述的Tris-HCL濃度為1. 2-1. 5mol/ L，PH 為 8. 2-8. 4。
[0017] 優選的，所述的離心速度為10000-12000轉/min。
[0018] 步驟⑷中PCR擴增採用的PCR引物為：
[0019] Inva 引物：F :CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ;
[0020] R：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0021] Hi la 引物：F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ;
[0022] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT〇
[0023] 優選的，所述的Mg2+試劑選自MgCL2或MgS0 4的一種或多種，所述的Mg2+試劑濃度 % 1. 5-2. 0mmol/L〇
[0024] 優選的，所述的PCR引物濃度為為8-10mmol/L。
[0025] 優選的，所述的Taq DNA聚合酶濃度為2_5U/ul。
[0026] 本發明與現有技術相比，有益效果體現在：
[0027] 1.本發明先對細菌先進行前增菌，然後進行選擇性增菌，並鑑定，可對食品中沙門 菌先進行定性檢測，操作簡便，為後續的PCR定量檢測提供了條件。
[0028] 2.本發明中對待測樣品進行細菌培養時，培養基不採用傳統的NaCl肉湯，而是採 用加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增養基，增菌效果好，多重PCR效果良好。
[0029] 3. Inva是調控沙門菌侵入上皮細胞的重要因子，也是產生致病性的重要因子， Hila也是毒力島SP11基因之一，與沙門菌對腸道上皮細胞的侵襲有關，本發明選擇沙門菌 特異的Inva及Hila基因，設計沙門菌PCR引物，進行二重PCR擴增，可特異性的檢測沙門 菌，提高檢測結果的特異性，減少假陽性。同時，對二重PCR擴增的反應條件進行了優化，避 免了引物間相互幹擾，提高了檢測結的敏感性。

【具體實施方式】
[0030] 實施例1
[0031] 一種食品中沙門菌的PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0032] (1)樣品預處理：準確稱取白木耳2g，粉碎，加入無菌生理鹽水進一步溶解；
[0033] (2)細菌培養：將步驟（1)中得到的白木耳置入加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的 CHRMagar顯色增養基中培養4h，取2g培養後紅色可疑菌落，繼續培養4h，將培養後的產物 進行細菌鑑定，取鑑定後的菌落加入無菌生理鹽水配製成菌懸液；
[0034] (3)DNA提取：取步驟（2)中的菌懸液5ml，離心5min，採用PBS緩衝液沉澱洗滌，重 復2次，煮沸5min，加入2mol/L NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入濃度為1. 2mol/L，PH為8. 2 的Tris-HCL緩衝液，離心，離心速度為10000轉/min取上清lul作為模板；
[0035] (4) PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟⑶中的模板進行PCR擴增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0036] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0037] Hila ：F ：CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ；
[0038] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0039] 反應體系：10XPCR buffer 緩衝液 2. 5ul，1. 5mmol/L 的 MgCl2 試劑 5ul，8mmol/L PCR引物5ul，2U/ul的Taq DNA聚合酶2ul，加純化水補足至25ul ;
[0040] 反應過程：95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進行30 個循環；最後72 °C延伸5min，得PCR擴增產物；
[0041] (5) PCR產物檢測：取步驟（4)中反應得到的PCR擴增產物5ul，進行凝膠電泳成 像。
[0042] 實施例2
[0043] 一種食品中沙門菌的PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0044] (1)樣品預處理：準確稱取香菇5g，粉碎，或量取液體樣品加入無菌生理鹽水進一 步溶解；
[0045] (2)細菌培養：將待測樣品置入加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增 養基中培養h，取5g培養後紅色可疑菌落，繼續培養6h，將培養後的產物進行細菌鑑定，取 鑑定後的菌落加入無菌生理鹽水配製成菌懸液；
[0046] (3)DNA提取：取步驟（2)中的菌懸液10ml，離心8min，採用PBS緩衝液沉澱洗滌， 重複5次，煮沸8min，加入5mol/L的NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入濃度為1. 5mol/L，PH為 8. 4的Tris-HCL緩衝液，離心，離心速度為12000轉/min取上清3ul作為模板；
[0047] (4) PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟⑶中的模板進行PCR擴增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0048] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0049] Hila ：F ：CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ；
[0050] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0051] 反應體系：10XPCR buffer 緩衝液 5ul，2. Ommol/L 的 MgS0410ul，lOmmol/L 的 PCR 引物10ul，5U/ul的Taq DNA聚合酶5ul，加純化水補足至25ul ;
[0052] 反應過程：95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進行30 個循環；最後72 °C延伸5min，得PCR擴增產物；
[0053] (5)PCR產物檢測：取步驟（4)中反應得到的PCR擴增產物10ul，分別進行凝膠電 泳成像。
[0054] 實施例3
[0055] -種食品中沙門菌的PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0056] (1)樣品預處理：準確量取碳酸飲料5ml，加入無菌生理鹽水進一步溶解；
[0057] (2)細菌培養：將待測樣品置入加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增 養基中培養5h，取3g培養後紅色可疑菌落，繼續培養5h，將培養後的產物進行細菌鑑定，取 鑑定後的菌落加入無菌生理鹽水配製成菌懸液；
[0058] (3)DNA提取：取步驟（2)中的菌懸液8ml，離心6min，採用PBS緩衝液沉澱洗滌， 重複3次，煮沸6min，加入3. 5mol/L的NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入1. 3mol/L，PH為8. 3 的Tris-HCL緩衝液，離心，離心速度為11000轉/min，取上清2ul作為模板；
[0059] (4) PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟⑶中的模板進行PCR擴增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0060] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0061] Hi 1 a :F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ;
[0062] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0063] 反應體系：10XPCR buffer 緩衝液 4ul，1. 8mmol/L 的 MgCL2 試劑 8ul，9mmol/L 的 PCR引物5-10ul，3U/ul的Taq DNA聚合酶3. 5ul，加純化水補足至25ul ;
[0064] 反應過程：95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進行30 個循環；最後72 °C延伸5min，得PCR擴增產物；
[0065] (5) PCR產物檢測：取步驟（4)中反應得到的PCR擴增產物5-10ul，分別進行凝膠 電泳成像。
[0066] 上述實施例僅為本發明的優選實施方式，並不應理解為對本發明的限定，本領域 技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明範疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保 護範圍之內。
【權利要求】
1. 一種食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟： (1) 樣品預處理：準確稱取固體樣品2-5g，粉碎，或量取液體樣品5-10ml，在粉碎後的 固體樣品及液體樣品中加入無菌生理鹽水進一步溶解； (2) 細菌培養：將待測樣品置入培養基中培養4-6h，取2-5g培養後紅色可疑菌落，繼續 培養4-6h，將培養後的產物進行細菌鑑定，取鑑定後的菌落加入無菌生理鹽水配製成菌懸 液； (3) DNA提取：取步驟（2)中的菌懸液5-10ml，離心5-8min，沉澱洗滌，煮沸5-8min，力口 入NaOH溶液懸浮菌體，冷卻加入Tris-HCL緩衝液，離心，取上清l-3ul作為模板； (4) PCR擴增：取沙門菌的引物對步驟（3)中的模板進行PCR擴增； 反應體系：l〇XPCR buffer 緩衝液 2. 5-5ul，Mg2+試劑 5-10ul，PCR 引物 5-10ul，Taq DNA聚合酶2-5ul，加純化水補足至25ul ; 反應過程：95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，進行30個循 環；最後72°C延伸5min，得PCR擴增產物； (5) PCR產物檢測：取步驟（4)中反應得到的PCR擴增產物5-10ul，進行凝膠電泳成像。
2. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特徵在於，步驟⑵中所述 的培養基為加入了亞硒酸鹽胱氨酸增菌液的CHRMagar顯色增養基。
3. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特徵在於，步驟⑶中所述 的沉澱洗滌均採用PBS緩衝液，所述的沉澱洗滌重複操作2-5次。
4. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特徵在於，步驟⑶中所述 的 NaOH 溶液濃度為 2-5mol/L，所述的 Tris-HCL 濃度為 1. 2-1. 5mol/L，PH 為 8. 2-8. 4。
5. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特徵在於，步驟⑶中所述 的離心速度為10000-12000轉/min。
6. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特徵在於，步驟（4)中PCR 擴增採用的PCR引物為： Inva 引物：F :CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ; R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ； Hila 引物：F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ; R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT〇
7. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特徵在於，步驟⑷中所述 的Mg2+試劑選自MgCL 2或MgS04的一種或多種，所述的Mg2+試劑濃度為1. 5-2. Ommol/L。
8. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特徵在於，步驟⑷中所述 的PCR引物濃度為為8-10mmol/L。
9. 根據權利要求1所述的食品中沙門菌的PCR檢測方法，其特徵在於，步驟⑷中所述 的Taq DNA聚合酶濃度為2-5U/ul。
【文檔編號】C12Q1/04GK104195240SQ201410404056
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月16日 優先權日:2014年8月16日
【發明者】郭狄 申請人:中山鼎晟生物科技有限公司