GmEDS1蛋白在促進水楊酸生物合成以及增強植物抗病中的應用的製作方法

2023-07-11 15:20:41 2

專利名稱：GmEDS1蛋白在促進水楊酸生物合成以及增強植物抗病中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及增強植物抗病性的蛋白、其編碼核苷酸序列與應用。本發明的某些方面涉及將本發明提供的GmEDSl蛋白編碼核苷酸序列導入植物細胞中，並使其表達，從而促進了植物水楊酸的合成以及增強植物的抗病性。
背景技術：
植物在栽培生產過程中常發生各種病害，一些病害對植物生長構成極大威脅，如根腐病、灰斑病等。對於農作物，這些病害嚴重損害其產量和質量。對於植物病害，目前主要採用藥物措施防治。最近人們開始應用非生物誘導劑誘導植物抗病性，並已廣泛應用於菸草、馬鈴薯、番茄、黃瓜、菜豆、水稻等多種重要農作物。這種措施的效果雖然理想，但成本較高，並汙染環境。因此，迫切需要開發新的生物學手段以提高植物自身的抗病性。系統獲得性抗性是植物的一種防禦反應，當植物遭受病原體和害蟲攻擊時，這種反應會被誘導，並且能夠迅速擴散到植株的其它部位以保護植物。病程相關蛋白I3R是一類逆境蛋白，被認為在植物的抗病中起重要作用，其中編碼PRl蛋白的基因常被用作植物抗病反應和系統獲得抗性中的指示基因，PRl基因的表達在植物抗病反應中起重要作用。水楊酸是廣泛存在於植物體內的酚類物質，被認為是誘發系統獲得性抗性的信號，可以誘導對病毒、細菌、真菌等多種病原體的抗性。研究表明，外施水楊酸後，PRl基因的轉錄被顯著激活。研究還發現，當植物某部位遭受病原體攻擊之後，植物體內水楊酸含量會增加，而且水楊酸的增加出現在PRl基因表達之前。(L Sticher, B Mauch-Mani，and JP Metraux. Systemic Acquired Resistance. Annual Review of Phytopathology,1997, 35 :235-270 ；ER Ward, SJ Uknes, SC Williams et al. , Coordinate Gene Activity in Response to Agents That Induce Systemic Acquired Resistance. The Plant Cell, 1991,3 :1085-1094)研究進一步發現，植物中水楊酸的合成在很大程度上是通過異分支酸合成酶 (ICS, isochorismate synthase) ICSl 作用於底物異分支酸(isochorismate)從而合成水楊酸。但目前對於植物水楊酸合成調控的研究報導還極為少見。EDSl (enhanced disease susc印tibility)是一種在植物系統獲得性抗性的信號傳導途徑中起著非常重要作用的基因，也是植物抗病過程中水楊酸積累所必需的。在擬南芥中它是一種閱讀框架為1836bp，可以編碼612個胺基酸的基因，根據胺基酸序列比對發現，雖然EDSl沒有明顯的跨膜結構域，但其氨末端具有和真核脂肪水解酶相似的活性位點，其可能處於植物抗病R基因介導的抗病信號通路的下遊。EDSl功能的缺失可以導致活性氧的產生以及水楊酸合成的降低，進而導致植物對病原菌抗性的減弱。然而，根據遺傳學表型和功能分析發現，EDSl和另一種抗病信號傳導途徑中非常重要的 NDRl (nonrace-specific disease resistance)基因在作用的傳導途徑上是完全不同的。EDSl是TIR-NB-LRR型R基因抗病過程的特異性關鍵蛋白。另外，研究還發現在植物對病原菌響應過程中，EDSl的功能是作為水楊酸依賴的PRl基因mRNA積累的上遊調控蛋白(Anders F. , Bart J. F. , Louise N. F. , etc. , EDSl, an essential component of R gene-mediated disease resistance in Arabidopsis has homology to eukaryotic lipases, Proc. Natl. Acad. Sci.，1999, (96) :3292-3297.)。
作為一種植物抗病信號傳導中非常重要的蛋白，對EDSl蛋白的生物工程研究具有重要理論和實際意義。但是目前對該基因在其它植物抗病基因工程研究還尚無報導。由於大豆的遺傳轉化目前仍然存在成功率低、周期長和對設備及人員要求高等一些難題，因此過量表達大豆的EDSl基因是否會誘導水楊酸合成和植物抗病基因的表達，進而可能提高植物抗病性，仍然沒有明確的答案。
發明概述
在一個方面，本發明提供了一種GmEDSl蛋白及其編碼核苷酸序列，以及該GmEDSl 蛋白的類似物蛋白及其編碼核苷酸序列。
在另一個方面，本發明提供了一種增強植物抗病性的方法。所述方法包括將編碼本發明GmEDSl蛋白的核苷酸序列導入植物細胞中，並使其表達。所述植物細胞可以來源於雙子葉植物或單子葉植物。所述病害可以是根腐病、灰斑病等。在某些實施方案中，所述植物細胞是大豆細胞。
在又一個方面，本發明提供了一種調節植物水楊酸合成的方法。所述方法包括將編碼本發明GmEDSl蛋白的核苷酸序列導入植物細胞中，並使其表達。在某些實施方案中， 所述植物細胞是大豆細胞。
在又一個方面，本發明提供了一種調控植物抗性基因表達的方法。所述方法包括將本發明GmEDSl蛋白的編碼核苷酸序列導入植物細胞中，並使其表達。在某些實施方案中，所述植物抗性基因是PRl基因。在一個具體的實施方案中，本發明GmEDSl蛋白通過調控植物水楊酸合成來調控植物抗性基因表達。
在又一個方面，本發明提供了生產具有增強的抗病性的植物的方法。所述方法包括提供表達編碼本發明GmEDSl蛋白的核苷酸序列的植物細胞，並在合適的條件下將所述植物細胞培養為植物。
進一步地，本發明提供了參與水楊酸合成調節的GmEDSl蛋白，其來源於大豆，可具有序列表中SEQ ID NO :2的胺基酸序列。其編碼核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO :1所7J\ ο
此外，本發明還提供了 GmEDSl蛋白的類似物蛋白，以及其編碼核苷酸序列。
附圖簡述


圖1為大豆GmEDSl基因PCR電泳圖。
圖2為擬南芥ICSl基因啟動子PCR電泳圖。
圖3為擬南芥PRl基因啟動子PCR電泳圖。
圖4顯示融合FLAG表達標籤的大豆GmEDSl基因表達載體圖。
圖5顯示擬南芥ICSl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體圖。
圖6顯示擬南芥PRl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體圖。
圖7顯示將大豆GmEDSl基因表達載體和擬南芥ICSl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉化原生質體後，GFP螢光蛋白的顯微鏡觀測結果。
圖8顯示將大豆GmEDSl基因表達載體和擬南芥ICSl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉化原生質體後，GFP螢光蛋白的Wfestern Blotting結果。
圖9顯示將大豆GmEDSl基因表達載體和擬南芥ICSl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉化原生質體後，FLAG蛋白的Wfestern Blotting結果。
圖10顯示將大豆GmEDSl基因表達載體和擬南芥PRl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉化原生質體後，GFP螢光蛋白的顯微鏡觀測結果。
圖11顯示將大豆GmEDSl基因表達載體和擬南芥PRl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉化原生質體後GFP螢光蛋白的Wfestern Blotting結果。
圖12顯示將大豆GmEDSl基因表達載體和擬南芥PRl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉化原生質體後FLAG蛋白的Wfestern Blotting結果。
發明詳述
定義
本說明書全篇中所用的術語應解釋為具有對本領域普通技術人員而言常規和典型的意義。然而，申請人希望給予下列術語如下特定含義。
術語「基本一致」相對於核苷酸序列而言可以被解釋為核苷酸序列與參考核酸序列有至少約85 %、90 %、95 %或97 %的序列一致性。
術語「一致」應解釋成，在比對序列並引入空隙(如果需要的話，以使整個序列達到最大的序列一致性百分比)之後，不考慮保守替代作為序列一致性的一部分時，候選序列中和與其比較的對應序列中相同的核苷酸的百分數。3』端或5』端延伸或插入不應被理解成減少了一致性或同源性。用於比對的方法和電腦程式是本領域所熟知的。用序列分析軟體可以測定序列一致性。
術語「植物」包括完整的植物、植物器官(例如，葉、莖、根，等)、種子等。
術語「嚴格雜交條件」通常指鹽濃度低於約1. 5M，通常為約0.01-1. 0M，pH在約 7. 0-8. 3之間，溫度在約30-60攝氏度之間。也可以通過添加去穩定劑，例如甲醯胺，來實現嚴格雜交條件。
術語「報告基因」通常指一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，也就是說，是一個其表達產物非常容易被鑑定的基因。把報告基因的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控。常見的報告基因包括GFP、FLAG等。
術語「類似物蛋白」應理解為指與GmEDSl蛋白不同的任何分子，但仍保留與 GmEDSl蛋白相似或基本相似的生物學功能，特別是調節植物水楊酸合成。在一些方面，類似物蛋白的基本整體結構與GmEDSl蛋白相似，或結構上僅與實現GmEDSl蛋白生物學功能的一個或多個區域或結構域的結構相似。典型地，可以通過向GmEDSl蛋白的胺基酸序列添加一個或多個胺基酸、從GmEDSl蛋白的胺基酸序列刪除一個或多個胺基酸、和/或置換GmEDSl蛋白的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸、和/或上述方式的組合提供或形成 GmEDSl蛋白的類似物蛋白。在一些方面，本發明涵蓋了導致胺基酸序列改變的胺基酸倒置和其它突變改變。可以通過向核酸分子中引入核苷酸改變，從而通過表達突變的核酸分子實現需要的胺基酸改變。胺基酸的取代可涉及保守的或非保守的胺基酸取代。
術語「胺基酸保守置換」指用特徵相似或基本相似的的另一個胺基酸來替換胺基酸殘基，基本不改變蛋白質的生物學功能。下表1中提供了示例性的胺基酸保守置換。在一些方面，具體的保守置換是G、A、V、I、L、M ；D、E、N、Q ;S、C、T ;K、R、H ；和P、N-α -烷基胺基酸。在一些方面，胺基酸保守置換可以基於以下選擇，它們對(a)取代區域中肽骨架的結構、(b)蛋白質在取代位點的電荷或疏水性、(c)在取代位點的側鏈體積、和/或上述方面的組合，不具有任何實質性的影響。表1 示例性胺基酸保守置換AlaVal*, Leu, IleArgLys 氺，Gin, AsnAsnGln氺，His, Lys, Arg, AspAspGlu*, AsnCysSerGlnAsn*, His, Lys,GluAsp*，γ-羧基穀氨酸(Gla)GlyProHisAsn, Gin, Lys, Arg氺lieLeu*, Val, Met, Ala, Phe, norleucine (Nle)LeuNle, lie*, Val, Met, Ala, PheLysArg*, Gin, Asn, ornithine (Orn)MetLeu*, lie, Phe, NlePheLeu*, Val, lie, AlaProGly*，羥脯氨酸(Hyp)，Ser, ThrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp, Phe*, Thr, SerVallie, Leu*, Met, Phe, Ala, Nle*表示優選的保守置換在一個方面，本發明提供了一種GmEDSl蛋白及其編碼核苷酸序列，以及其類似物蛋白及其編碼核苷酸序列。進一步地，本發明提供了參與水楊酸合成調節的GmEDSl蛋白，其來源於大豆，可具有序列表中SEQ ID NO :2的胺基酸序列。其編碼核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO :1所
7J\ ο此外，本發明還提供了 GmEDSl蛋白的類似物蛋白，以及其編碼核苷酸序列。在另一個方面，本發明提供了一種增強植物抗病性的方法。所述方法包括將本發明GmEDSl蛋白的編碼核苷酸序列導入植物細胞中，並使其表達。所述植物細胞可以來源於雙子葉植物或單子葉植物。所述病害可以是根腐病、灰斑病。在某些實施方案中，所述植物可以是大豆。在又一個方面，本發明提供了一種調節植物水楊酸合成的方法。所述方法包括將本發明GmEDSl蛋白的編碼核苷酸序列導入植物細胞中，並使其表達。
在又一個方面，本發明提供了一種調控植物抗性基因表達的方法。所述方法包括將本發明GmEDSl蛋白的編碼核苷酸序列導入植物細胞中，並使其表達。在某些實施方案中，所述植物抗性基因是PRl基因。在一個具體的實施方案中，本發明GmEDSl蛋白通過調控植物水楊酸合成來調控植物抗性基因表達。在又一個方面，本發明提供了生產具有增強的抗病性的植物。所述方法包括提供表達編碼本發明GmEDSl蛋白的核苷酸序列的植物細胞，並在合適的條件下將所述植物細胞培養為植物。在本發明的一個實施方案中，將篩選獲得的可能參與植物水楊酸合成調節的候選基因，融合到含有FLAG報告基因的轉化表達載體中，通過與連接有誘導水楊酸合成關鍵基因-異分支酸合成酶基因(ICSl)-啟動子的GFP報告基因的轉化表達載體共同瞬時轉化植物原生質體，根據螢光顯微鏡觀察植物原生質體是否產生綠色螢光。並提取原生質體總蛋白，分別用GFP和FLAG的抗體進行Western Blotting試驗，最終鑑定篩選到的候選蛋白是否能夠調節水楊酸合成。在另一個實施方案中，本發明提供了一種可以誘導ICSl基因啟動子的GmEDSl蛋白及其編碼核苷酸序列。實驗證明，將本發明的核苷酸序列構建到表達載體，與連接有誘導 ICSl基因啟動子的GFP報告基因的表達載體共同轉化到擬南芥原生質體後，可以在原生質體的細胞質中觀察到綠色螢光的產生，這說明所述GmEDSl蛋白能夠調控ICSl的啟動子起始轉錄。Western Blotting雜交的結果也再次證明了 GFP蛋白的增加是因為所述GmEDSl 蛋白的表達所引起的。在另一個實施方案中，本發明提供了一種可以誘導PRl基因啟動子的GmEDSl蛋白及其編碼核苷酸序列。實驗證明，將本發明的核苷酸序列構建到表達載體，與連接有誘導 PRl基因啟動子的GFP報告基因的表達載體共同轉化到擬南芥原生質體後，可以在原生質體的細胞質中觀察到綠色螢光的產生，這說明所述GmEDSl蛋白能夠調控PRl的啟動子起始轉錄。Western Blotting雜交的結果也再次證明了 GFP蛋白的表達是因為所述GmEDSl蛋白的表達所引起的。不受任何理論的約束，本發明的發明人認為所述GmEDSl蛋白通過調控植物水楊酸合成促進了抗病基因PRl啟動子的起始轉錄。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明做進一步詳細說明。下述實施例中所用方法如無特別說明，則均為常規方法。具體步驟可參見 ((Molecular Cloning :A Laboratory Manual))(Sambrook J. ,Russell,David W. ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd edition,2001, NY,Cold Spring Harbor)。 Mffi弓L 合成及DNA序列測定，均由北京英駿生物有限公司進行。GmEDSl 基因的獲f導檢索Phytozome資料庫及文獻，獲得GmEDSl基因的序列(登錄號 Glyma04g34800)，設計正向引物5，> GCGAGCTCATGGCTGGAGGGTTGCTTG > 3，和反向引物 5， > CCGCTCGAGGGAAGGAAGTGACCCTGAGTT > 3，。提取大豆葉片的 RNA，通過反轉錄得到 cDNA， 用TaKaRa公司I^rimeSTAR HS高保真酶的方法將該基因擴增出來，構建到3^-FLAG表達載體中，將連接產物通過熱激方法轉化進大腸桿菌DH5 α菌株，挑選陽性菌落加入到2. 5ml含50mg/L氨苄黴素的LB液體培養基中，在37°C、180rpm的搖床中培養12-16小時。小量提取質粒，酶切鑑定正確後，送英駿生物公司進行序列測定。將測序正確的質粒用QIAGEN生物公司的質粒大提試劑盒進行質粒大提，最終將質粒濃度定為2ug/ul，OD2607280介於1. 8到 2. 0之間，用於後面的擬南芥原生質體轉化試驗。根據本實驗所設計的引物，最終成功克隆到了全長為1836bp的GmEDSl基因(其核苷酸序列為SEQ ID NO :1所示序列)，電泳結果參見圖1，其中M代表核苷酸的marker， 為 TaKaRa 公司的 DL2000。t施例2、擬南芥水楊酸合成關鍵某因ICSl某因啟動子(ProAtIcsl)的獲得檢索NCBI資料庫及文獻，獲得AtICSl的序列(登錄號AT1G74710)， 根據生物信息學的方法分析啟動子序列，根據其序列分析結果，分別設計正向引物5，> AACTGCAGTTATCCACGCTTTGTCACACA >3，和反向引物 5，> CGGGATCCCCATTGCAGAAATTCGTAAAGT > 3，。提取擬南芥葉片的RNA，通過反轉錄得到cDNA， 用TaKaRa公司I^rimeSTAR HS高保真酶的方法將該基因擴增出來，構建到326-GFP表達載體中，將連接產物通過熱激方法轉化進大腸桿菌DH5 α菌株，挑選陽性菌落加入到2. 5ml含 100mg/L氨苄黴素的LB液體培養基中，在37°C、180rpm的搖床中培養12-16小時。小量提取質粒，酶切鑑定正確後，送英駿生物公司進行序列測定。將測序正確的質粒用QIAGEN生物公司的質粒大提試劑盒進行質粒大提，最終將質粒濃度定為2ug/ul，OD2607280介於1. 8到 2. O之間，以用於後面的擬南芥原生質體轉化試驗。根據本實驗所設計的引物，最終成功克隆到了全長為2102bp的擬南芥ICSl基因啟動子核苷酸片段(其核苷酸序列為SEQ ID NO :3所示序列)，電泳結果參見圖2，其中M 代表核苷酸的marker，為TaKaRa公司的DL2000。3、擬南芥棺4勿抗病基因PRl啟動子(Pro^)的獲得檢索NCBI資料庫及文獻，獲得AtPRl的序列(登錄號AT2G14610)， 根據生物信息學的方法分析啟動子序列，根據其序列分析結果，分別設計正向引物5，> AACTGCAGTGGCAAATAAACAACGGACA >3，和反向引物 5，> CCGCTCGAGTAAAATTCATTTTTCTAAGTTGA > 3，。提取擬南芥葉片的RNA，通過反轉錄得到cDNA， 用TaKaRa公司I^rimeSTAR HS高保真酶的方法將該基因擴增出來，構建到326-GFP表達載體中，將連接產物通過熱激方法轉化進大腸桿菌DH5 α菌株，挑選陽性菌落加入到2. 5ml含 100mg/L氨苄黴素的LB液體培養基中，在37°C、180rpm的搖床中培養12-16小時。小量提取質粒，酶切鑑定正確後，送英駿生物公司進行序列測定。將測序正確的質粒用QIAGEN生物公司的質粒大提試劑盒進行質粒大提，最終將質粒濃度定為2ug/ul，OD2607280介於1. 8到 2. O之間，以用於後面的擬南芥原生質體轉化試驗。根據本實驗所設計的引物，最終成功克隆到了全長為1939bp的擬南芥PRl基因啟動子核苷酸片段(其核苷酸序列為SEQ ID NO :4所示序列)，電泳結果參見圖3，其中M代表核苷酸的marker，為TaKaRa公司的DL2000。實施例4、擬南芥原生質體的轉化實施例4. U326-Pro,tIcsl: :GFP表達載體與326-GmEDSl :FLAG表達載體的轉化將構建正確的3^_ProAtresi GFP表達載體(參見圖5 ；GFP的核苷酸序列為 SEQ IDNO :5所示序列)，分別與構建正確的Me-GmEDSl :FLAG表達載體(參見圖4)和3^-T7-FLC表達載體共同轉化擬南芥原生質體。採用PEG介導的擬南芥葉片原生質體瞬時表達的方法。在MS培養基上萌發擬南芥種子，待根長至1-3釐米時即可移栽到土裡，溫室培養，光照12h/12h，150 μ E0準備好一個90mm培養皿，稱1. 82g D-甘露醇於20ml雙蒸水中。培養皿的蓋子用來切葉片。取4周後未抽薹前的葉片，約90片。切成Imm寬的長條， 置於甘露醇溶液中。配酶解液，IOOml三角瓶，15ml酶解體系。將細條撈出，置於酶解液中。 黑暗，23°C，40-50rpm酶解3小時。酶解液過100-200目的篩子，將過濾後的綠色混合物置於15ml離心管(直徑約Icm)中，均分為兩管。4°C，60g，15分鐘。棄上清，沉澱用冰冷的 W5溶液輕柔洗滌，每管。4°C，100g, 1分鐘。棄上清，沉澱用冰冷的W5溶液輕柔洗滌，每管鈿1。冰上放置30分鐘。23°C，100g，l分鐘。棄上清，每管沉澱用0.5ml MaMg重懸。共轉化時，每種質粒取約15ug於IOml管中，加300ul原生質體。用200ul槍頭(剪去前端) 輕柔混勻。加入310ulPEG4000/Ca(NO3)2溶液，輕柔混勻。放置20-30分鐘。加入Iml W5 溶液，來回顛倒混勻。23°C，100g，l分鐘。棄上清，加IOOul W5，混勻。加900ul W5，混勻。 上述混合液體置於六孔板內，230C，弱光，孵育6-18小時。螢光觀察，觀察之後常溫IOOg離心2分鐘，終體積控制在50ul，液氮速凍之後，置於-80°C保存。實施例4. 2、326-ProWR1: :GFP表汰載體與326-GmEDSl :FLAG表汰載體的轉化按照實施例4. 1所述方法，將構建正確的326_ftx)AtPK1: GFP表達載體(參見圖6)， 分別與構建正確的326-GmEDSl :FLAG表達載體(參見圖4)和326_T7_FLC表達載體共同轉化擬南芥原生質體。實施例5、轉化後擬南芥原生質體的螢光顯微鏡觀察吸取轉化後的擬南芥原生質體30ul，置於載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片後，放於 ZEISSAXI0SK0P螢光顯微鏡下進行觀察和拍照。實施例5. U326-Pro,tIcsl: :GFP表達載體與326-GmEDSl FLAG表達載體轉化的擬南芥原生質體轉化了 3^-ProAtiesi: :GFP和326-GmEDSl FLAG載體的擬南芥原生質體的螢光顯微鏡觀察結果參見圖7，分別進行了螢光觀測和明場觀測。根據圖7所示，我們可以得到在螢光觀測下，在共同轉化了 3^-ProAtiesi: :GFP和326__GmEDSl :FLAG載體的原生質體中， 出現了與轉化326-GFP載體的正對照相同的綠色螢光。並且此時作為負對照的共同轉化 326-ProAtIcsl: :GFP和326_T7_FLC載體的原生質體並不能觀察到明顯的綠色螢光。這樣的結果表明，GmEDSl表達的蛋白，可以與ICSl啟動子區作用，並且促使其後續GFP基因的表達。 因此可以判斷，GmEDSl基因在正調控水楊酸合成關鍵酶ICSl的啟動子上，起到了促進的作用。實施例5. 2、326-ProWR1: :GFP表達載體與326-GmEDSl FLAG表達載體轉化的擬南芥原生質體轉化了 3^-ProAtPK1 :GFP和326-GmEDSl FLAG表達載體的擬南芥原生質體的螢光顯微鏡觀察結果參見圖10。分別進行了螢光觀測和明場觀測。根據圖10所示，我們可以得到在螢光觀測下，在共同轉化了 3^-ProAtPK1: :GFP和326-GmEDSl FLAG載體的原生質體中，出現了與轉化326-GFP載體的正對照相同的綠色螢光。並且此時作為負對照的共同轉化326-ProAtPK1: :GFP和326_T7_FLC載體的原生質體並不能觀察到明顯的綠色螢光。這樣的結果表明，GmEDSl蛋白促進了水楊酸的合成關鍵酶ICSl基因的表達，並且最終可以導致抗病基因PRl啟動子起始轉錄，並且促使其後續GFP基因的表達。不受任何理論的約束，本發明的發明人認為GmEDSl基因通過調控植物水楊酸的合成促進了抗病基因PRl啟動子的起始轉錄。t施例6、轉化後擬南芥原牛質體總可溶蛋白的Western Blotting檢測丨將轉化後的擬南芥原生質體加入等體積2 X上樣緩衝液，沸水煮5分鐘，離心後用於SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳分離膠採用濃度12%的均一膠，濃縮膠濃度為4%。分離膠之上覆蓋一層長度約Icm的4%濃縮膠。本試驗電流採用20mA/板。電泳完畢後切去濃縮膠等多餘部分，並切去凝膠的右上角作為上樣順序標記。電泳凝膠在轉膜緩衝液中平衡10-20分鐘。之後剪取與電泳凝膠大小一樣的PVDF膜，也在右上角做一標記。之後先用甲醇浸潤10秒，用水衝洗之後放入轉膜緩衝液中平衡10分鐘。然後打開半乾轉膜儀，依次放置三層濾紙、PVDF膜、電泳凝膠、三層濾紙，合上轉膜儀頂蓋。操作過程中，一定要將膜與膠之間的氣泡全部趕出，最後再次確定蛋白是從負極到正極移動。 待裝好電轉移裝置後，設定電流大小為所轉膜面積的0.8倍，即I (mA) =Area(Cm2)XO. 8, 電轉移1. 5小時。電轉移完成後，將PVDF膜取出放在培養皿中，將與凝膠接觸的一面向上，用TTBS 短暫衝洗後加入TTBS封閉液(TTBS+5%脫脂奶粉)，4°C封閉2小時以上。當膜封閉好之後，按1 2000 (ν/ν)稀釋倍數加入GFP或者FLAG的一抗，4°C結合過夜。第二天用TTBS洗滌3次，每次5分鐘。然後按照1 5000 (ν/ν)稀釋倍數，加入羊抗鼠的辣根過氧化物酶HRP抗體，4°C結合2小時。再用TTBS洗滌3次，每次5分鐘。將ECL超敏化學發光液(普利萊生物公司)A和B等體積混合後加到膜上，用保鮮膜包裹平整後，在暗室中壓上X光膠片，曝光顯影、定影。最後待X光膠片晾乾之後，掃描保存。實施例6. U326-Pro,tIcsl: :GFP表達載體與326_GmEDSl :FLAG表達載體轉化的擬南芥原生質體對轉化3^-ProAtiesi :GFP和326_GmEDSl :FLAG載體後的擬南芥原生質體，進行總可溶蛋白的Western Blotting檢測。結果參見圖8，當用Anti-GFP抗體雜交時我們發現，在共同轉化了 326-ftOAtIcsl: :GFP和326-GmEDSl:FLAG載體的原生質體中，出現了與326-GFP 正對照相同條帶，可以確定為GFP條帶，而在作為負對照的共同轉化3^-ProAtresi: :GFP和 326-T7-FLC載體的原生質體中，並沒有GFP蛋白信號。為了判斷GFP的產生是否與GmEDSl蛋白有關，我們又用Anti-FLAG抗體與三種轉化的原生質體進行了 Western Blotting檢測，結果參見圖9。實驗結果發現，對轉化 326-ProAtIcsl :GFP 和 326_GmEDSl :FLAG 載體的擬南芥原生質體中，326_GmEDSl :FLAG 確實得到了表達，這就進一步從蛋白水平說明了 GmEDSl基因所表達的蛋白，可以與ICSl的啟動子區作用，並且促使其後續GFP基因的表達。因此可以判斷，GmEDSl基因在正調控水楊酸合成關鍵酶基因ICSl的啟動子上，起到了促進的作用。實施例6. 2、326-ProWR1 :GFP表達載體與326_GmEDSl :FLAG表達載體轉化的擬南芥原生質體對轉化3^-ProAtPK1: :GFP和326_GmEDSl :FLAG載體後的擬南芥原生質體，進行總可溶蛋白的Astern Blotting檢測。結果參見圖11，當用Anti-GFP抗體雜交時我們發現，在共同轉化了 326-ftOAtPK1: :GFP和326-GmEDSl:FLAG載體的原生質體中，出現了與326-GFP 正對照相同條帶，可以確定為GFP條帶，而在作為負對照的共同轉化3^-ProAtPK1: :GFP和 326-T7-FLC載體的原生質體中，並沒有GFP蛋白信號。為了判斷GFP的產生是否與GmEDSl蛋白有關，我們又用Anti-FLAG抗體與三種轉化的原生質體進行了 Western Blotting檢測，結果參見圖12。實驗結果發現，對轉化 326-ProAtPE1: :GFP 和 326_GmEDSl :FLAG 載體的擬南芥原生質體中，326_GmEDSl :FLAG 確實得到了表達，這也進一步說明了 GmEDSl蛋白誘導了擬南芥原生質體中水楊酸合成關鍵酶 ICSl基因的表達，並且最終可以導致下遊抗病基因rai啟動子起始轉錄，促使了後續GFP基因的表達。不受任何理論的約束，本發明的發明人認為GmEDSl基因通過調控植物水楊酸的合成促進了抗病基因PRl啟動子的表達。本說明書中提及的所有出版物都通過引用納入本文中。本說明書中對文獻、操作、 材料、儀器、文章等的任何討論，都僅為本發明公開的實施方式提供上下文背景。不應將其視為承認這些材料中的任一或全部形成現有技術基礎的一部分、或者是本發明相關領域的常規知識。如本說明書顯示的，在不背離所公開的本發明精神或範圍的前提下，可以根據公開的實施方式產生多種變化和/或修飾，這對本領域技術人員是顯而易見的。因此，在各方面，本發明的實施方式都應認為是示例性而非限制性的。
權利要求
1.一種調節植物中水楊酸合成的方法，該方法包括將編碼下述蛋白的核苷酸序列導入植物細胞，並使該核苷酸序列表達(i)所述蛋白具有SEQID NO 2的胺基酸序列；或(ii)通過置換、缺失或添加SEQID NO :2胺基酸序列中的胺基酸而形成的類似物蛋白，該類似物蛋白可以調節植物中水楊酸的合成。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述置換是胺基酸保守置換。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列為SEQID NO :1所示序列。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列在嚴格雜交條件下可以與SEQID NO 1核苷酸序列的互補序列雜交。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列的核苷酸序列與SEQID N0:1核苷酸序列基本一致。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述核苷酸序列的核苷酸序列與SEQID N0:1核苷酸序列具有至少90%的一致性
7.如權利要求1所述的方法，其中所述蛋白通過調控所述植物中異分支酸合成酶基因啟動子來調節該植物中水楊酸的合成。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述異分支酸合成酶基因啟動子具有SEQID NO 3 的核苷酸序列。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述植物細胞來源於雙子葉植物或單子葉植物。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述植物細胞是大豆細胞。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述病害包括根腐病、灰斑病。
12.—種生產具有增強的病害抗性的植物的方法，該方法包括(a)提供表達編碼下述蛋白的核苷酸序列的植物細胞(i)所述蛋白具有SEQID NO 2的胺基酸序列；或(ii)通過置換、缺失或添加SEQID NO :2胺基酸序列中的胺基酸而形成的類似物蛋白，該類似物蛋白可以增強植物對病害的抗性；和(b)將所述植物細胞培養為植物。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述蛋白通過調節所述植物中水楊酸的合成來使該植物的病害抗性增強。
全文摘要
本發明是GmEDS1蛋白在促進水楊酸生物合成以及增強植物抗病中的應用。本發明涉及生產具有增強的病害抗性的植物的方法。在某些方面，本發明提供了一種GmEDS1蛋白及其編碼基因，該蛋白通過調控植物中水楊酸的合成，增強了植物的抗病性。
文檔編號C12N5/10GK102477432SQ201010555009
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月23日 優先權日2010年11月23日
發明者周曉鋒, 蔡斌, 金京波 申請人:中國科學院植物研究所