一株彎曲乳桿菌及其應用的製作方法

2023-07-11 03:39:26

一株彎曲乳桿菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株彎曲乳桿菌及其應用。本發明公開一株彎曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)，其保藏編號為CGMCC No.9388。本發明公開的彎曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)IMC-12，具有較強的產生H2O2的能力，可有效抑制外來的病原菌和其他條件致病菌的生長，同時又具有較強的對陰道上皮細胞的粘附作用，保證了菌株在陰道上皮的定植，彎曲乳桿菌IMC-12在泌尿生殖道感染防治方面具有一定的應用前景。
CGMCC No.9388
2014.06.27
【專利說明】一株彎曲乳桿菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株彎曲乳桿菌及其應用，屬於微生物領域。

【背景技術】
[0002] 泌尿生殖道感染為婦女最為常見但又未受到重視的多發病，發病率僅次於呼吸 道感染，可高達40% ;女性泌尿生殖道感染是尿路感染和生殖道感染的總稱，它不僅直接影 響婦女的身心健康，而且也會影響眾多家庭的幸福和穩定，進而影響全社會的人口質量和 經濟發展。女性尿路感染常見的病原是革蘭氏陰性桿菌，其中以大腸埃希菌最多見，葡萄 球菌次之；這些多數為人體腸道及皮膚黏膜上的正常菌群，由於機體免疫力下降，這些細 菌可由腸道及皮膚黏膜等寄居部位遷移至泌尿系統並大量繁殖引起尿路感染。女性常見的 生殖道感染病原包括滴蟲、黴菌和衣原體等，生殖道感染絕大多數先由陰道感染而起；因病 情遷延擴散可引起盆腔炎，並導致不孕症。泌尿生殖道感染是"小疾病，大麻煩"，還可增加 愛滋病和淋病等性病的危險；患者生活質量明顯下降，精神負擔很重。妊娠婦女可出現一系 列妊娠併發症，如早產及絨毛膜羊膜炎等不良妊娠結局；分娩時由產道還可直接使新生兒 受同類病原體感染而致病。
[0003] 目前，泌尿生殖道感染的治療主要依靠各種抗生素，但治療效果不佳，治癒率在 40%以下，而且復發的比例很高，可達40%以上。原因主要是患者生殖道內耐藥性病原菌的 存在致使抗生素失效；另外，抗生素治療即使可以殺死病原菌，但同時也殺死了有益菌（益 生菌），因此，難以恢復健康狀態下的泌尿生殖道優勢菌群。
[0004] 健康育齡婦女泌尿生殖道內存在著大量的細菌，總稱為泌尿生殖道菌群，其中包 括多種不同種類的細菌，可粗略分為"有益菌"和"致病菌"兩大類，其中乳酸桿菌是維持泌 尿生殖道健康最常見和最重要的有益菌（"正義菌"），大腸埃希菌、葡萄球菌、滴蟲、黴菌和 衣原體則為致病菌（"邪惡菌")。某些因素導致某一種致病菌異常增殖，引起泌尿生殖道感 染。陰道內細菌種類的變化與婦女和胎兒的健康密切相關，其中的彎曲乳桿菌和詹氏乳酸 桿菌是維持陰道健康微生態環境的主要優勢"正義菌"，可佔健康泌尿生殖道菌群細菌總量 的90%以上。它們主要通過抑制外來的病原菌和其他條件致病菌（"邪惡菌"）的生長和 侵入來維持泌尿生殖道菌群的健康環境，"正義菌（有益菌）"戰勝"邪惡菌"的作用機制主 要包括以下幾方面：（1)通過分解陰道黏膜上皮中貯存的糖原產生乳酸、乙酸等酸性物質， 維持陰道的酸性環境，以抑制病原菌的的生長；（2)產生過氧化氫和乳酸菌素等多種抑菌 物質，用以殺死入侵的病原菌；（3)乳酸桿菌類有益菌通過在陰道黏膜上皮定植後，會形 成先入為主的佔位保護作用，阻止病原微生物的入侵。
[0005] 育齡婦女隨年齡增長，陰道內彎曲乳桿菌或詹氏乳酸桿菌數量會逐漸減少。絕經 後，卵巢雌激素分泌逐漸停止，陰道上皮細胞糖原儲備缺乏，陰道pH上升，彎曲乳桿菌 或詹氏乳酸桿菌會進一步減少，致病菌因而增多。所以，彎曲乳桿菌或詹氏乳酸桿菌對老 年婦女的泌尿生殖健康也具有重要作用。
[0006] 微生態學理論認為，通過生態製劑調整療法，扶正和保護陰道內的優勢菌群的組 成和比例，可以驅除外來"邪惡的"致病菌的侵擾，提高婦女本身固有的"扶正祛邪"的自 我保護作用。乳桿菌是健康婦女陰道菌群的優勢菌群，佔陰道細菌總量90%以上，泌尿生殖 道感染患者陰道乳酸桿菌明顯減少，有的甚至完全檢測不到，因此，喪失了抵禦外來病原菌 感染的能力。而通過補充缺失的乳桿菌，則有利於重建女性泌尿生殖道的優勢菌群，恢復其 固有的"扶正祛邪"的保護作用。
[0007] 泌尿生殖道感染是婦女的常見病、多發病、易於復發，用抗生素雖有較好的短期 療效，但卻有40%的復發率。研究證明：有保護作用的優勢菌株一彎曲乳桿菌或詹氏乳酸 桿菌的製劑將更容易在陰道內定居和增殖，並產生抗菌物質，發揮持久的作用。因此，開 發適應我國婦女特點的特異性陰道乳桿菌製劑市場前景廣闊，改變以往在治療泌尿生殖道 感染上的純粹殺菌的用藥指導思想，避免由於大量應用抗生素作為治療所帶來的一系列不 良反應和弊端，有利於恢復女性泌尿生殖道的優勢菌群並重建其微生態平衡；從而有效降 低泌尿生殖道感染的復發率，真正治癒女性泌尿生殖道感染。
[0008] 目前，國內女性泌尿生殖道感染用益生菌菌劑只有一種，其主要成分是德氏乳杆 菌活菌。雖然它是從健康婦女陰道分離出來的一種乳桿菌，但不是我國婦女陰道菌群中的 主要有益菌，我國健康婦女陰道細菌以彎曲乳桿菌為主。


【發明內容】

[0009] 本發明的目的是提供一株彎曲乳桿菌及其應用。
[0010] 本發明提供一株彎曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus)，其保藏編號為CGMCC No.9388 ；
[0011] 所述彎曲乳桿菌的菌落直徑大小約1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，菌落邊 緣整齊、較溼潤，大小形態穩定；革蘭染色陽性；處於對數生長期的所述彎曲乳桿菌經鑑定 為無芽胞的桿菌，無鞭毛；兼性厭氧，生長最適溫度37-42°C，最適pH5. 8-6. 2,可發酵葡萄 糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖等多種糖。
[0012] 一種菌劑也屬於本發明的保護範圍，含有上述彎曲乳桿菌和/或上述彎曲乳桿菌 的發酵物。
[0013] 上述彎曲乳桿菌或上述菌劑在製備維持酸性環境的產品中的應用也屬於本發明 的保護範圍；
[0014] 所述酸性環境具體為泌尿生殖道的酸性環境，再具體為人的泌尿生殖道的酸性環 境；
[0015] 所述泌尿生殖道具體為陰道。
[0016] 上述彎曲乳桿菌或上述菌劑在製備抑制病原菌和/或條件致病菌的生長和/或繁 殖的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍；
[0017] 所述病原菌和/或條件致病菌具體為泌尿生殖道的病原菌和/或條件致病菌，再 具體為人的泌尿生殖道的病原菌和/或條件致病菌；
[0018] 所述泌尿生殖道具體為陰道。
[0019] 上述彎曲乳桿菌或上述菌劑在製備對泌尿生殖道的上皮細胞具有粘附定植能力 的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0020] 上述彎曲乳桿菌或上述菌劑在製備預防和/或治療泌尿生殖道感染的產品中的 應用也屬於本發明的保護範圍。
[0021] 上述彎曲乳桿菌或上述菌劑在製備預防和/或治療泌尿生殖道感染進而引發的 疾病的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0022] 上述任一所述的應用中，所述泌尿生殖道為陰道。
[0023] 本發明提供的彎曲乳桿菌（Lactobacillus, crispatus) IMC-12,具有較強的產生 H202的能力，可有效抑制外來的病原菌和其他條件致病菌的生長，同時又具有較強的對陰道 上皮細胞的粘附作用，保證了菌株在陰道上皮的定植。彎曲乳桿菌頂C-12在泌尿生殖道感 染防治方面具有一定的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為彎曲乳桿菌MC-12菌落。
[0025] 圖2為彎曲乳桿菌MC-12與陰道上皮細胞的粘附作用。

【具體實施方式】
[0026] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0027] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0028] 健康婦女陰道分泌物樣品由瀚思維康健康管理機構提供。
[0029] MRS液體培養基的製備：將蛋白腖10. 0g，牛肉膏10. 0g，酵母膏5. 0g，檸檬酸 氫二銨2. 0g，葡萄糖20. 0g，吐溫801.0mL，乙酸鈉（CH3C00Na · 3H20)5. 0g，磷酸氫二鉀 (Κ2ΗΡ04 · 3Η20)2· 0g，硫酸鎂（MgS04 · 7Η20)0· 58g，硫酸錳（MnS04 · Η20)0· 25g 溶於蒸餾水， 並用蒸饋水定容至l〇〇〇mL，調至pH至6· 2-6. 6。
[0030] 實施例1、彎曲乳桿菌菌株的分離和鑑定
[0031] 一、彎曲乳桿菌菌株的分離
[0032] 將收集的200餘例臨床檢測無陰道炎症狀體徵的健康婦女陰道分泌物樣品依次 編號，並接種於MRS液體培養基，37°C厭氧培養24h。每個樣本隨機挑選5個單菌落於2mL MRS液體培養基中培養增菌24h，並對菌落依次編號。將分離到的數百株細菌分別進行菌種 鑑定、產過氧化氫及與陰道上皮細胞粘附作用的檢測，把其中一株具有較強粘附作用且產 過氧化氫的彎曲乳桿菌命名為頂C-12。
[0033] 二、彎曲乳桿菌菌株的鑑定
[0034] (一）形態學鑑定
[0035] 在MRS乳酸桿菌培養基平板上，上述步驟一分離得到的菌株MC-12表現為菌落 直徑大小約1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落邊緣整齊、較溼潤，大小形態穩定 (如圖1所示）。
[0036] 處於對數生長期的所述彎曲乳桿菌經鑑定為：革蘭染色陽性，無芽胞的桿菌，無鞭 毛。
[0037] (二）生理生化特徵分析
[0038] 菌株頂C-12兼性厭氧，生長最適溫度37-42°C，最適ρΗ5· 8-6. 2。根據API細菌鑑 定標準，利用API 50 CHL培養基和API 50 CH試劑條（購自bioMe' rieux，Inc.，Marcy Γ Etoile，France)對檢測菌株頂C-12進行糖發酵反應判讀檢測菌株頂C-12的生理生化 特徵。API 50 CHL是由49種可發酵碳水化合物的API 50 CH試驗條組成的簡易培養基。 以檢測菌株IMC-12製成懸液接種試驗條的每一個小管。當培養時，由於發酵碳水化合物產 酸，pH下降，使指示劑變色。
[0039] 結果顯示，菌株MC-12可發酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖等多種糖。
[0040] (三）16s rDNA序列同源性分析
[0041] 提取菌株MC-12的總DNA作為模板，採用通用引物27f和1492r進行PCR擴增， 得到含有菌株MC-1216S rRNA基因保守區的片段。
[0042] 27f (上遊引物）：5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，（SEQ ID No. 1);
[0043] 1492r (下遊引物）：5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3' （SEQ ID No. 2)。
[0044] PCR體系（25 μ L) :PCR擴增緩衝液，終濃度為200 μ mol/L dNTPs，終濃度均為 0· 2 μ mol/L的上遊及下遊引物，1 U Taq DNA聚合酶，1 μ L模板DNA，餘量為ddH20。
[0045] PCR 條件：94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 40s，72°C延伸 30s，共 25 個 循環；72°C延伸lOmin。
[0046] PCR擴增得到的菌株頂C-12的16s rDNA的序列如SEQ ID No. 3所示。
[0047] 菌株IMC-12的分類命名為彎曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus)，該菌株已於 2014年6月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地 址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為 CGMCC No. 9388。
[0048] 實施例2、彎曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus) IMC-12的功能分析
[0049] 一、彎曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus) IMC-12 產 H202 的檢測
[0050] ( -）H202標準曲線的製作：首先用濃度為100mmol/L的哌嗪-N，Ν' -二-乙磺酸 (Piperazine_N，N_-Bis 2-ethanesulfonic acid，PIPES)的水溶液將體積百分含量為 30% 的H202水溶液（相當於9. 128mol/L)儲存液稀釋成lmol/L，再用lOOmmol/LPIPES的水溶液 將上述 lmol/L 的 H202 分別稀釋成 20 μ mol/L、40 μ mol/L、60 μ mol/L、80 μ mol/L、100 μ mol/ L，將上述各稀釋液以及100mm〇l/L PIPES的水溶液記作H202工作液；然後分別取100μ L 上述H202工作液與100 μ L濃度為20mmol/L的TMB (四甲基聯苯胺）的水溶液、2 μ L濃度 為lmg/mL的辣根過氧化物酶（購自TaKaRa公司）混合，16°C孵育10min，測量0D63Q值。以 H202的濃度（單位：μ mol/L)為橫坐標，0D63(I為縱坐標，製作標準曲線，得到標準曲線公式 y = 0. 0033X-0. 0496, R2 = 0. 992。
[0051] (二）彎曲乳桿菌IMC-12液體培養H202濃度檢測：挑取彎曲乳桿菌IMC-12菌落， 將其接種於MRS液體培養基，在厭氧條件下進行培養48h，取lmL接種於10mL MRS液體培養 基中，使培養液中菌的濃度為l〇5cfu/ml，於厭氧環境下，37°C靜置培養21h後，轉換為37°C 振蕩培養3h，轉速為220r/min，旋轉半徑為2. 54cm。培養結束後，收集培養液，12000r/min 離心2min，得上清。取100 μ L上清與100 μ L濃度為20mmol/L的TMB (四甲基聯苯胺）的 水溶液、2 μ L濃度為lmg/mL的辣根過氧化物酶（購自TaKaRa公司）混合，16°C孵育10min， 測量(》63(|值，將其帶入步驟（一）得到的標準曲線公式，計算上清中的H 202濃度。實驗重 復三次，結果取平均值。
[0052] 結果如表1所示。
[0053] 表1彎曲乳桿菌頂C-12產生H202的能力檢測
[0054]

【權利要求】
1. 一株彎曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus)，其保藏編號為 CGMCC No. 9388。
2. -種菌劑，含有權利要求1所述的彎曲乳桿菌和/或權利要求1所述的彎曲乳桿菌 的發酵物。
3. 權利要求1所述的彎曲乳桿菌或權利要求2所述的菌劑在製備維持酸性環境的產品 中的應用。
4. 權利要求1所述的彎曲乳桿菌或權利要求2所述的菌劑在製備抑制病原菌和/或條 件致病菌的生長和/或繁殖的產品中的應用。
5. 權利要求1所述的彎曲乳桿菌或權利要求2所述的菌劑在製備對泌尿生殖道的上皮 細胞具有粘附定植能力的產品中的應用。
6. 權利要求1所述的彎曲乳桿菌或權利要求2所述的菌劑在製備預防和/或治療泌尿 生殖道感染的產品中的應用。
7. 權利要求1所述的彎曲乳桿菌或權利要求2所述的菌劑在製備預防和/或治療泌尿 生殖道感染進而引發的疾病的產品中的應用。
8. 根據權利要求5-7任一所述的應用，其特徵在於：所述泌尿生殖道為陰道。
【文檔編號】A61P13/00GK104232537SQ201410446067
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】朱寶利, 張瑞芬, 李晶, 王江 申請人:中國科學院微生物研究所