胚胎幹細胞特有小分子多肽es61編碼基因的克隆方法
2023-07-13 00:53:46 1
胚胎幹細胞特有小分子多肽es61編碼基因的克隆方法
【專利摘要】本發明提供了一種胚胎幹細胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法，步驟如下：（1）提取人絨毛組織總RNA，然後將總RNA反轉錄成cDNA；（2）設計PCR擴增引物將目標基因擴增出來；（3）PCR產物的回收和純化；（4）基因酶切連接轉化。本發明的能夠有效克隆該ES61編碼基因，方便了以後ES61多肽基因的定量檢測，為以後研究ES61多肽基因功能奠定了基礎。
【專利說明】胚胎幹細胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程領域，具體涉及一種胚胎幹細胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法。
【背景技術】
[0002]人胚胎幹細胞(Embryonic Stem cell, ES細胞)是在胚胎發育早期存在的一類細胞，具有全能性，能分化成為生物體的各個組織器官；RP4-792G4.2 (NCBI登陸號HG492132.1)基因是目前發現特異性表達於ES細胞等多能幹細胞中的一類不能翻譯蛋白質的ncRNA (non-coding RNA, ncRNA),研究發現,RP4-792G4.2基因可以編碼一種有61個氛基酸組成的多肽，命名為ES61多肽，編碼ES61多肽的核苷酸序列由183個鹼基組成，編碼61個胺基酸，此胺基酸經過生物信息學分析存在典型分泌信號肽序列。
[0003]目前尚沒有人報導針對該多肽ES61編碼基因的克隆方法，因此難以完成對該ES61多肽基因的定量檢測，以進一步研究該多肽的功能。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對以上要解決的技術問題，提供一種有效的針對胚胎幹細胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法。
[0005]為了實現以上技術目的，本發明公開了一種胚胎幹細胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法，步驟如下:
[0006](I)提取人絨毛組織總RNA，然後將總RNA反轉錄成cDNA ；
[0007](2 )設計PCR擴增引物將目標基因擴增出來；
[0008](3) PCR產物的回收和純化；
[0009](4)基因酶切連接轉化。
[0010]根據本發明的方法，所述步驟(2)的具體操作為:在ES61後面添加HA標籤序列，上下遊引物兩端分別添加XhoI和HindIII限制性內切酶序列，引物擴增片段總長度為234bp ;將目標片段克隆連接到PLEGFP-N1真核生物表達載體中，引物序列如下:
[0011]ES61-F:5』-CGGCTCGAGACCATGAACTCGCAGATGCCGCTC-3，
[0012]
【權利要求】
1.一種胚胎幹細胞特有小分子多肽ES61編碼基因的克隆方法，步驟如下: (I)提取人絨毛組織總RNA，然後將總RNA反轉錄成cDNA ； (2 )設計PCR擴增引物將目標基因擴增出來； (3)PCR產物的回收和純化； (4)基因酶切、連接、轉化。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(2)的具體操作為:在ES61後面添加HA標籤序列，上下遊引物兩端分別添加XhoI和HindIII限制性內切酶序列，引物擴增片段總長度為234bp ;將目標片段克隆連接到PLEGFP-N1真核生物表達載體中，引物序列如下:
ES61-F:5，-CGGCTCGAGACCATGAACTCGCAGATGCCGCTC-3，ES61 -R: St -CCCMGCTTAGCC/mATCTGGAACATCGTATGGGT+ACATGGCGGCCTTGCACTCCGCGT-1f 用上述引物配合如下反應體系=PCR為50 μ I總體系，具體是5XPhusion HFBufferlOy 1,2.5mM dNTPmix5 μ 1，IOmM 的上下遊引物各 2 μ l,2U/y I 的 Phusion DNA聚合酶0.8 μ I，人絨毛組織cDNA模板2 μ I，用滅菌水補足50 μ I體系，反應條件為「降落PCR」:95 0C 5min預變性，循環內98°C IOs變性，從68°C每個循環降1°C退火，72°C延伸20s, 10個循環；在60°C退火，進行25個循環；PCR反應循環後72°C繼續延伸7min，然後16°C保存。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述步驟(4)中，用XhoI和HindIII酶對上述PCR產物和PLEGFP-N載體進行雙酶切，酶切反應體系如下:10X Buffer4 μ I，DNA約2 μ g，內切酶(?ου/μ I)各1μ 1，滅菌去離子水補足到40μ 1，反應條件37°C、lhr。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述步驟(4)中，連接反應體系如下:目的片段DNA2y 1，PLEGFP-N1載體0.5μ 1，了4連接酶1「 I, IOX T4Bufferl μ I滅菌去離子水補足到10 μ 1，22。。連接30min。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(4)中，轉化步驟如下:取連接產物加到100 μ 1DH5 α感受態細胞中，混勻，冰浴30分鐘；將上述轉化液置於42°C水浴90秒，取出後立即置於冰浴中放置2-3分鐘；向其中加入900μ 137°C預熱的LB培養基，150rpm、37°C振蕩培養45分鐘；2500rpm離心5min，將上清液吸走，留100 μ I混勻菌液，加到含Kana抗生素LB固體瓊脂培養基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻塗開；待平板表面乾燥後，倒置平板，37°C培養12-16小時。
【文檔編號】C12N15/10GK103865920SQ201310753802
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】張茂雷, 陳杰 申請人:廣州達恩基因科技有限公司