巴曲酶基因的合成及其表達產物的純化製備的製作方法

2023-07-05 22:02:06

專利名稱：巴曲酶基因的合成及其表達產物的純化製備的製作方法
技術領域：
本發明是有關採用重組DNA技術生產一種源於蝮蛇屬毒蛇毒液中的巴曲酶(Batroxobin)蛋白，特別是巴曲酶基因的合成、表達以及表達產物的純化製備和性質確證。
背景技術：
1963年奧地利學者Von Klobusitzky從巴西矛頭蛇(Bothrops atrox)毒液中分離得到一種絲氨酸蛋白水解酶，也就是所謂的巴曲酶。從那以後，研究者已經從蝮蛇屬不同毒蛇的毒液中得到了不下於二十種絲氨酸蛋白酶類分子，它們都能夠酶切哺乳動物的血漿纖維蛋白原，使之轉變為纖維蛋白，從而影響動物的出血-凝血過程。在這些蛋白酶中，尤其對巴曲酶的物理、化學性質與臨床應用研究的較為清楚(Stocker K.，Barlow G.H.，Methods Enzymol.45214～223，1976)。
巴曲酶的特異性作用底物是纖維蛋白原，與凝血酶不同的是，它只切割纖維蛋白原的A鏈，而不作用B鏈。當它水解血漿纖維蛋白原A鏈中的Arg16-Gly17位肽鍵時，能夠釋放出纖維蛋白肽A，從而快速地將血液中的纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，接著這些纖維蛋白就能聚集成疏鬆的易於被纖維蛋白酶水解的血栓來封閉傷口，實現快速止血的功效。不過，在使用較大劑量的時侯，巴曲酶有降低血中纖維蛋白原濃度，改善血液黏度和血液的流體力學特性，從而起到降纖酶的功效(US Pat.No3849252，1974)。基於這樣一些生物化學特性，巴曲酶已經被成功地開發成止血藥(商品名Reptilase或Hemocoagulase)和降纖藥(商品名Defibrase)。在歐洲，巴曲酶正在替代人凝血酶作為止血藥物。
在國內，考慮到其分子的功能有類似凝血酶(Thrombin)之處，現中譯名稱為『血凝酶』。早先也有『蝮蛇血凝酶』、『蛇凝血素酶』等說法。由瀋陽賽諾、長春斯達、北京賽生和蓬萊華泰四家製藥公司聯合研製的『立止血』仿製品『巴曲亭』也已於2001年8月開發成功，該藥(保護期為2001.8.21～2007.8.21)也是從蛇毒中提取製備而成。不過需要說明的是，根據英國藥典(增補版)(MARTINDALE The Extra Pharmacopoeia，Thirty-first Edition，Edited by James E F Reynolds，Royal Pharma-ceutical Society，London，1996，P756)和默克索引(The Merck Index，1989，P1017)中描述，商品名為Reptilase(中文商品名為「立止血」)或Hemocoagulase的藥物，其主要成分是巴曲酶，另外還含有凝血因子X激活物(Factor-X Activator，例如，RVV-X蛋白等成分)。
雖然研究者對巴曲酶的性質有了比較多的了解，但是，對這種蛇毒成分的分子生物學研究一直進展緩慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成對巴曲酶基因的cDNA和基因組DNA測序工作(Nobuyuki Itoh etalJ.Biol.Chem.262(7)3132～3135，1987；J.Biol.Chem.，2637628～7631，1998)。1991年日本藤澤製藥公司(Fujisawa Pharmaceutical)的研究者採用基因重組方法，在E.coli中，採用融合表達系統，以包涵體(Inclusion Body)的形式表達出該成分，再通過製備電泳和凝血酶切割開融合蛋白的方法據報導得到所謂有生物學活性巴曲酶(Maeda M etal，J Biochem(Tokyo)，109(4)632-637，1991)，而且還為此申請了專利(Pat.No.JP2124092，1990)。但是，自此後，只有從蛇毒中提取製備的巴曲酶用於治療多種臨床適應症(如，心肌梗死、老年痴呆、中風、突發性耳聾等等)的專利(USPat.No5595974，5869044，6106830，6399576，6416717；Eur.Pat.No0984279，0826374，0750912，0719791)和研究報告，再也沒有重組巴曲酶用於動物試驗和臨床研究工作的任何相關研究報導。目前，國內對於巴曲酶藥效學方面的研究報導頗多，尚未見對該成分進行重組表達的文獻或報告。
巴曲酶蛋白雖然只有一條肽鏈，但是由於分子內二硫鍵多，還有糖基化修飾等，所以採用基因工程手段生產這種蛋白有很大的技術難度。這也應該是這一直沒有重組產品問世的主要原因之一。
成熟的巴曲酶分子是由231個胺基酸殘基組成的單鏈蛋白，理論計算出其分子量為25.5kD，等電點為7.39，國外從Bothrops atrox毒液中生物提取的巴曲酶的實際分子量為42kD，這種分子量的偏差是由於糖基化修飾緣故。從巴曲酶蛋白質一級結構中可以發現，其分子內有兩個N-糖基化位點Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228。此外，Bothrops atrox的其它亞種以及其它種類毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不過其分子量從29.1kD到42kD不等，這可能是由於不同亞種之間胺基酸組成上差別或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12個半胱氨酸，根據已知的絲氨酸蛋白酶類分子的研究結果，推測這12個半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、Cys26-Cys42、Cys74-Cys230、Cys118-Cys184、Cys150-Cys168和Cys174-Cys199這六種分子內二硫鍵的形成。考慮到從蛇的毒液中提取巴曲酶的生產成本以及進一步研究其結構的需要，我們採用基因工程的方法生產重組巴曲酶。
採用基因工程的手段生產富含二硫鍵的蛋白一直都是一個技術難題，尤其是生產有多對二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶類分子。這是因為二硫鍵配對錯誤率很高，在原核中得到的幾乎全是包涵體，雖然通過對包涵體的變性-復性能得到少量有活性的目的蛋白，但是其成本決定了不具備實際生產意義。真核細胞表達系統(酵母、CHO和昆蟲細胞等)中能保證較高二硫鍵配對正確率，因此本專利是採用甲醇酵母系統。我們在甲醇酵母(Pichiapastoris，Pichia methanolica)中成功地表達出了有生物學活性的巴曲酶蛋白，產量能達到每毫升發酵液20克氏單位(20KU/ml)，這一產量已經初步具備生產意義。
根據美國Genebank中公開的巴曲酶(X12747)的胺基酸序列資料，選擇酵母或E.coli都能較喜好的遺傳密碼子，人工合成巴曲酶全基因序列，分別將該基因插入到E.coli表達載體(如pET、pGEX類載體，用IPTG誘導；或pLY、PBV200載體，用熱誘導；pLEX載體，用色氨酸誘導)中進行融合或非融合表達的研究；或插入到Pichia pastoris的分泌型表達載體pPIC9，pPIC9K，pPICZa類載體或pPIC3K類胞內表達載體，或插入到Pichia methanolica的分泌型表達載體pMETa類載體或pMET類胞內表達載體中進行分泌表達的研究。另外，也完全採用甲醇酵母喜好的密碼子人工全合成巴曲酶基因，比較研究了這兩個巴曲酶基因在表達產量上的差別。
雖然在E.coli中表達某些蛋白已經是較為常規的生產藥用蛋白的基本手段，但是在對巴曲酶蛋白的實際研究中發現，無論採用融合(同GST、Trx或Nus融合)或是非融合表達(N端多一個蛋氨酸)巴曲酶蛋白，所得到的都是不溶的、無活性的包涵體，雖然表達量可以達到比較高的水平(約佔菌體總蛋白的20～30％)。將表達載體轉入Novagen公司新推出的適合表達多二硫鍵蛋白的宿主菌AD494和Origami中也無濟於事。這種包涵體經變性-復性過程後，得到的可溶性蛋白並沒有檢測到任何活性。
巴曲酶一級結構中有三個可能的酵母膜蛋白酶Kex2敏感位點(Arg44-Arg45、Lys77-Lys78-Lys79、Arg203-Lys204)，一般情況下，這會可能會導致分泌的目的蛋白發生降解，降低有效表達量，從誘導後的上清中的確發現有降解的蛋白條帶。不過通過優化發酵過程中的一系列條件，最終目的蛋白的表達量還是能夠滿足規模化生產需要的(圖3)。所以，我們選擇在在甲醇酵母Pichiapastoris和Pichia methanolica中對巴曲酶的高效表達。

發明內容
1.巴曲酶基因(Batroxobin gene，Bg)的合成、測序以及表達載體的構建為使目的基因能插入pPICZaA或pMETaA載體，在Bg的5`-端添加限制酶XhoI的切點，3`-端添加TAA TGA雙終止密碼以及NotI切點，另在XhoI切點與巴曲酶蛋白N-端第一個胺基酸Val密碼子之間加入KEX2蛋白酶識別序列Lys-Arg對應的密碼子AAA AGA，這就確保目的蛋白在分泌到發酵上清液中時能夠順利地切除a-信號肽(圖1)或巴曲酶自身的信號肽序列，使工程菌表達的巴曲酶具有同蛇毒中提取的該蛋白一樣的N-端胺基酸序列。
基因的拼接過程採用遞歸式PCR(Recursive PCR)方法，將最終PCR產物柱回收，經XhoI、NotI雙酶切，再膠回收符合設計Bg長度的DNA片段，插入到pPICZaA或pMETaA載體中(圖2)，挑選LZ(LB+25ug/mlZeocin)平板上的單克隆，LZ培養基液體培養，提取質粒，XhoI-NotI雙酶切篩選含有Bg長度的克隆6個，用進行a-factor priming和3`-AOX1priming測序引物分別從Bg基因的5`-端和3`-端進行測序，最終得到一個完全合乎原設計要求的克隆，該克隆中含有表達載體pPICZaA-Bg可以用來轉化Pichia pastoris X-33和GS115His+宿主菌。
將測序正確的Bg基因從pPICZaA-Bg表達載體中用XhoI-NotI雙酶切切出，再轉插入pMETaA載體的XhoI-NotI限制酶位點之間，構造pMETaA-Bg表達載體，該表達載體用來轉化Pichia methanolica PMAD11宿主菌。鹼解法大量製備上述兩種表達質粒載體，供轉化酵母之需。
2.巴曲酶的表達及表達產物的活性測定
1.1.pPICZaA-Bg線性化後轉化Pichia pastoris X-33用DNA限制性內切酶SacI將pPICZaA-Bg線性化，按照Invitrogen公司P.methanolica Expression Kit Version B中的方法(P21～23)製備酵母宿主菌的感受態並進行電轉化，將轉化後的細胞鋪在YPD+500ug/ml Zeocin瓊脂糖平板(1％Yeast extract，2％Polypeptone，2％Glucose，1.5％Agar，500ug/ml Zeocin)上鋪板，30℃下放置3～4天，可見有酵母單克隆長出。在500ug/ml～600ug/ml Zeocin濃度條件下，平均每個轉化約有200～400個克隆不等。如果將Zeocin的濃度減低，克隆數將極成倍增加，採用此方法進行的電轉時，用500～600ug/ml的Zeocin，也適合該表達載體插入其他基因。挑選菌落大而飽滿的克隆進行表達篩選。
2.2.pMETaA-Bg線性化後轉化Pichia methanolica PMAD11用DNA限制性內切酶KpnI將pMETaA-Bg線性化，採用與上相同的方法，轉化PMAD11(Pichia methanolica)，並將轉化後的酵母在MD瓊脂糖(1.34％YNB，4×10-5％Biotin，2％Glucose，1.5％Agar)平板上鋪板，30℃下放置3～4天，待長出單克隆後，轉入4℃～8℃下放置3~4天，可見有少量酵母單克隆微微帶點紅色，這是轉化不成功的，僅挑大而飽滿呈乳白色的克隆進行表達篩選。平均每個轉化大約克得到500～1000個克隆。
2.3.工程菌的篩選將上述2.1、2.2中得到的克隆按照Invitrogen公司操作手冊中要求進行表達、篩選，得到高表達的菌株。
2.4.表達產物的活性測定參照從蛇毒中提取的巴曲酶的測活方法，用加入了檸檬酸鈉的人標準血漿可以對發酵上清液中表達出的酶活性進行測定，這即可以對克隆進行篩選，也可以對工程菌的產量高低進行測評。具體測定活性的標準就是37℃下，將100ul的發酵上清液加入到300ul含檸檬酸鈉的人標準血漿中，混勻後，觀察凝固所需的時間。
本專利中巴曲酶的表達產量和純化中各階段的活力測定均用使血漿凝固所用的分鐘數表示，其含義是100ul的發酵液或含巴曲酶的溶液使300ul的人標準血漿凝固所需時間。
3.巴曲酶工程菌的上罐發酵及表達產物的純化製備3.1工程菌的上罐發酵用在試管中篩選出的高表達的工程菌(表達量為15～20mins)，接種到搖瓶中增殖作為種子液，再轉接至30L發酵罐，按甲醇酵母發酵的常規方法進行中試規模的發酵。誘導50小時後，表達量為40secs～1min。
3.2發酵上清液的純化製備將發酵上清液大體積稀釋或超濾濃縮脫鹽，使上樣液的PH和離子強度(即電導率)適合離子交換層析的要求。第一步進行陽離子交換層析，我們選擇強陽離子交換介質，洗脫出的目的蛋白再上樣至強陰離子交換介質，最後經過一步分子篩，即可以得到純度合乎要求的巴曲酶(見圖3)。


圖1巴曲酶基因同信號肽序列之間連接關係SEQ-2是適合在酵母和E.coli中表達的巴曲酶結構基因部分；SEQ-3是適合在酵母中高表達的巴曲酶結構基因部分；SEQ-5為巴曲酶天然信號肽序列所對應的DNA序列。Aa-信號肽同巴曲酶結構基因連接；B巴曲酶天然信號肽同其結構基因連接，中間插入了KEX2識別序列。
圖2巴曲酶基因表達載體(pPICZaA-Bg)的構造圖3巴曲酶蛋白的SDS-PAGE電泳1.未誘導時的發酵上清液；2.誘導72小時後的發酵上清液；3.純化出的巴曲酶；M蛋白中分子量標準(LMW Marker Kit，Amersham Pharmacia Biotech)圖4酶切除去巴曲酶的糖鏈A.未經PNGase F酶切處理的巴曲酶；B.PNGase F酶切處理1小時後的巴曲酶，其中B1條帶是尚未切除糖鏈的，而B2條帶是切去N-糖鏈的巴曲酶；M.蛋白中分子量標準(LMW Marker Kit，Amersham Pharmacia Biotech)具體實施方式
實施例1遞歸PCR法獲得巴曲酶基因(Bg-EP；Bg-P)根據Genbank X12747中公布的巴曲酶蛋白的胺基酸序列，人工合成了巴曲酶的全基因。為了實現巴曲酶在不同宿主菌(E.cili和酵母)中的高效表達，分別合成了兩種巴曲酶基因(SEQ-2，SEQ-3)一個是兼顧E.coli和甲醇酵母喜好密碼子的巴曲酶基因(Bg-EP)，一個是完全選擇甲醇酵母喜好密碼子組成的基因(Bg-P)。利用DNA分析軟體分析全長的Bg基因，將整個基因分割成22條片段，合成這些片段，每相鄰引物間互補的粘端長度不低於15個鹼基對，巴曲酶基因的5`-端引物上帶有XhoI切點和Kex2識別序列胺基酸所對應的密碼子，3`-端引物上帶有雙終止密碼子(TAA和TAG)以及EcoRI切點。通過PCR法拼接Bg-EP和Bg-P基因。各引物片段之間連接次序參見圖1。
實施例2巴曲酶基因Bg-EP、Bg-P的表達1.酵母中表達巴曲酶基因Bg-EP、Bg-PBg-EP插入到pPICZaA載體的多克隆位點Xho-NotI之間，轉化Pichia pastoris宿主菌X-33。按照Invitrogen公司Pichia pastorisExpression Kit中的方法進行表達篩選。活性測定是利用巴曲酶能酶切纖維蛋白原，使含檸檬酸鈉的人血漿凝固這一方法來進行的。挑取含500ug/ml抗生素Zeocin的YPD平板生長出的酵母菌落，實際總共篩選了80個克隆，表達量從40mins到15mins不等。將篩出的40min、30min、25min和15min的菌種上罐發酵，在甲醇誘導50hrs後，表達量差別並不顯著。同樣將Bg-P插入到pPICZaA中，所得到的工程菌表達產量同Bg-EP並沒有顯著的差別。單從表達產物的活性來看，Bg基因(Bg-EP、Bg-P)在酵母中的表達產量有明顯的極限現象，試管中篩選出的40min產量和15min產量的菌種在發酵罐中的活性表達量差別不顯著。雖然在相當於巴曲酶蛋白位置的條帶明顯變濃，但是活性沒有增加。
2.E.coli中表達巴曲酶基因Bg-EP分別合成了Bg-EP基因的如下三條5`-端引物，它們分別帶有BglII、BamH1和EcoRI酶切位點引物1(P1)5`-CATAGATCTAGAT GAT GAC GAT AAA GTT ATC GGT GGT GAT GAA TG-3`引物2(P2)5`-CATGGATCCGAT GAT GAC GAT AAA GTT ATC GGT GGT GAT GAA TG-3`引物3(P3)5`-CATGAATTCATG GTT ATC GGT GGT GAT GAA TG-3`以pPICZa-Bg-EP為模板，分別用上述三條5`-端引物與前面基因拼接時用的引物BP22，經過PCR就可以將變換基因兩端的切點，把Bg-EP插入到不同的表達載體之中。上述三條引物中下劃線的部分為DNA限制性內切酶識別序列，粗體字母部分為巴曲酶基因Bg-EP的5`-端互補配對序列，其中引物-1(P1)、引物-2(P2)的限制酶位點與Bg-EP之間為腸激酶(Enterkinase)識別序列，用腸激酶可以將以融合蛋白表達出的巴曲酶切開，釋放出巴曲酶蛋白。引物-3(P3)的限制酶位點與Bg-EP間是蛋氨酸起始密碼子，插入到載體中將產生N-端多一個蛋氨酸殘基的巴曲酶蛋白。
2.1利用Novagen公司的PET系列表達系統以P1、BP22為引物，pPICZaA-Bg-EP質粒為模板，PCR出長度約為730bp的基因片段，經BglII-NotI雙切後插入到同樣經這兩種酶雙切的PET32a(+)載體中，轉化感受態的NovaBlue宿主菌，雙酶切篩選插入目的片段的克隆，用質粒抽提試劑盒抽提質粒，轉化BL21(DE3)或Origami(DE3)，在LA+Agar板上鋪板，挑陽性克隆接種到LA培養液增殖培養，IPTG誘導就可以表達出Trx-Batroxoboin融合蛋白。
2.2利用Amersham Pharmacia Biotech公司的pGEX系列表達系統以P2、BP22為引物，pPICZaA-Bg-EP質粒為模板，PCR出長度約為730bp的基因片段，經BamHI-NotI雙切後插入到同樣這兩種酶切的pGEX4T-1中，直接轉化BL21宿主菌，挑陽性克隆，接種到LA培養液中，用IPTG誘導，SDS-PAGE電泳檢測表達出合乎理論大小融合蛋白的克隆，即是含有目的基因的工程菌。為進一步確認，可抽提質粒再雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳驗證。
2.3利用熱誘導型表達載體pLY表達系統pLY表達載體是PBV系列載體的變異體，它最大的特點是帶有cIt568，使表達載體對宿主菌沒有特別的要求。用EcoRI，NotI雙切pLY載體。以P3、BP22為引物，pPICZaA-Bg-EP質粒為模板，PCR出長度約為710bp的基因片段，經EcoRI、NotI雙切後插入到上面處理過的pLY載體中，轉化BL21，在LA培養液中增殖，43℃~45℃的條件下進行熱誘導，SDS-PAGE電泳表達出分子量約為26kD蛋白條帶的克隆就是篩選出的工程菌，從中抽提。
上述在E.coli中表達的產物都是包涵體蛋白，幾乎沒有可溶性的目的蛋白或目的蛋白融合蛋白。破菌液中未能測出巴曲酶活性。PET32a-Bg-EP表達載體表達的Trx-Batroxobin中含有His-Tag，可以採用Ni2+Chelating HP介質進行純化。按照Life Science News 8，2001 Innovations Forum，AmershamPharmacia Biotech發布的包涵體純化-復性方法，得到了可溶性融合蛋白，用腸激酶酶切後，釋放出了目的蛋白，但是目的蛋白也沒有活性。另外兩種表達系統表達的產物也都如此。總之，未能在E.coli中表達出有活性巴曲酶蛋白。據此，推測日本藤澤製藥公司的研究者所得到的有活性的成分可能是殘留的凝血酶。
實施例3發酵上清液中巴曲酶的純化製備用冰醋酸調節發酵上清液使PH為4.0後，再用蒸餾水將發酵液按1∶20稀釋使電導率為≤8mS/cm，將此發酵稀釋液先上樣到經25mM醋酸-醋酸鈉緩衝，PH4.0預先平衡過的SP-Sepharose FF(Amersham PharmaciaBiotech)柱，採用梯度洗脫，得到目的蛋白粗品，再用蒸餾水和PH為10.0的1M甘氨酸-氫氧化鈉溶液，將含巴曲酶的SP-Sepharose FF洗脫液稀釋、調節成50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩衝，PH10.0，電導率≤3.5mS/cm的上樣緩衝液，再上經50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩衝，PH10.0預平衡的Q-SepharoseFF(Amersham Pharmacia Biotech)柱，採用下調PH的方式，進行梯度洗脫，使目的蛋白在100mM的醋酸-醋酸鈉緩衝，PH4.0中洗脫，最後再通過S200(PAmersham Pharmacia Biotech)分步收集就可以得到純度不低於97％的巴曲酶純品(圖.4)。PH梯度洗脫分別採用如下摩爾濃度及PH的緩衝溶液25mM Na2HPO4-NaH2PO4，PH8.850mM Na2HPO4-NaH2PO4，PH7.0100mM HAc-AcNa，PH5.0採用緩衝液摩爾濃度遞增的方式可保證PH梯度變換明顯，減少洗脫過程中可能出現的拖尾現象，同時高濃度的緩衝也發揮了鹽(離子強度)的洗脫效應。
實施例4發酵上清液中摺疊錯誤巴曲酶蛋白的復性實施例2中描述到酵母表達巴曲酶時發現，隨著誘導時間延長，在巴曲酶蛋白分子大小相應位置的蛋白條帶明顯變濃，但是活性並沒有增加。由此推測，這些蛋白似乎是分泌過程中摺疊錯誤的巴曲酶。為確認這一推測的正確與否，特採用下面的試劑對含有這種蛋白的溶液進行復性試驗。
具體復性操作復性之前，其巴曲酶活力為30hrs(1800mins)，當向含無活性蛋白條帶的溶液中加入如下試劑，使終濃度如後面括弧中所示的濃度，在15℃條件下，隔絕空氣，放置12hrs左右之後，測定其巴曲酶活力為30mins。
Na2HPO4-NaH2PO4，PH8.0 (100mM)Histidine(組氨酸)(10mM)GSH(還原型穀胱甘肽) (0.5mM)GSSG(氧化型穀胱甘肽)(0.3mM)含上述成分的水溶液，並未測出活性，這表明活性是由無活性蛋白復性後的產生的，而不是所添加的成分產生的假象。
實施例5巴曲酶蛋白分子中糖基化結構的確定根據巴曲酶胺基酸序列資料計算出該蛋白的分子量為25.5kD，而SDS-PAGE電泳得出的表觀分子量在30～32Kd之間。用我們純化出的巴曲酶，質譜法測出準確的分子量為31.8kD。
參考甲醇酵母表達系統在表達的外源蛋白時，只要蛋白分子一級結構中有N-糖基化的可能位點，一般都會N-型糖基化現象。用New EnglandBioLabs公司的商品蛋白酶PNGase F(切割糖蛋白中N-糖鏈的酶)，按照使用說明書中的方法進行操作，將處理前後的巴曲酶蛋白SDS-PAGE電泳後發現PNGase F處理後的巴曲酶分子量減小了，大小同大腸桿菌非融合表達的產物相當(圖4)。這表明酵母表達出的巴曲酶分子內有N-糖基化等修飾。蛋白質和DNA序列描述SEQ-1序列的資料(1).序列特徵a.長度231胺基酸b.類型胺基酸c.拓撲學未知(2).分子類型蛋白質(3).序列描述SEQ-11 VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEWVLTAA HCNRRFMRIH51 LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN VITDKDIMLI RLDRPVKNSE101 HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI MGWGAITTSE DTYPDVPHCA NINLFNNTVC151 REAYNGLPAK TLCAGVLQGG IDTCGGDSGG PLICNGQFQG ILSWGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPWIQS IIAGNKTATC PSEQ-2序列的資料(1).序列特徵a.長度693bpb.類型核甘酸c.拓撲學線性(2).分子類型人工合成的DNA(3).序列描述SEQ-21 GTTATCGGTG GTGATGAATG TGATATTAAC GAACATCCAT TCTTGGCCTT51 TATGTATTAT TCTCCACGTT ATTTCTGTGG TATGACCTTG ATTAACCAAG101 AGTGGGTTTT GACCGCCGCC CATTGTAACC GTCGTTTTAT GCGTATTCAT
151 TTGGGTAAAC ATGCCGGTTC TGTTGCCAAC TATGATGAAG TTGTTCGTTA201 TCCAAAAGAA AAGTTTATTT GTCCAAACAA GAAAAAGAAC GTTATTACCG251 ATAAAGATAT CATGTTGATT CGTTTGGATC GTCCAGTTAA AAACTCTGAA301 CATATTGCCC CATTGTCTTT GCCATCTAAC CCACCATCTG TTGGTTCTGT351 TTGTCGTATT ATGGGTTGGG GTGCCATTAC CACCTCTGAA GATACCTATC401 CAGATGTTCC ACATTGTGCC AACATTAACT TGTTTAACAA CACCGTTTGT451 CGTGAAGCCT ATAACGGTTT GCCAGCCAAA ACCTTGTGTG CCGGTGTTTT501 GCAGGGTGGT ATCGATACCT GTGGTGGTGA TTCTGGTGGT CCATTGATTT551 GTAACGGTCA GTTCCAGGGT ATTTTGTCTT GGGGTTCTGA TCCATGTGCC601 GAACCACGTA AACCAGCCTT TTATACCAAA GTTTTTGATT ATTTGCCTTG651 GATTCAGTCT ATTATTGCCG GTAACAAAAC CGCCACCTGT CCASEQ-3的資料(1).序列特徵a.長度693bpb.類型核甘酸c.拓撲學線性(2).分子類型人工合成的DNA(3).序列描述SEQ-31 GTTATTGGTG GTGATGAATG TGATATTAAC GAACATCCAT TTTTGGCTTT51 TATGTACTAC TCTCCAAGAT ACTTTTGTGG TATGACTTTG ATTAACCAAG101 AATGGGTTTT GACTGCTGCT CATTGTAACA GAAGATTTAT GAGAATTCAT
151 TTGGGTAAGC ATGCTGGTTC TGTTGCTAAC TACGATGAAG TTGTTAGATA201 CCCAAAGGAA AAGTTTATTT GTCCAAACAA GAAGAAGAAC GTTATTACTG251 ATAAGGATAT TATGTTGATT AGATTGGATA GACCAGTTAA GAACTCTGAA301 CATATTGCTC CATTGTCTTT GCCATCTAAC CCACCATCTG TTGGTTCTGT351 TTGTAGAATT ATGGGTTGGG GTGCTATTAC TACTTCTGAA GATACTTACC401 CAGATGTTCC ACATTGTGCT AACATTAACT TGTTTAACAA CACTGTTTGT451 AGAGAAGCTT ACAACGGTTT GCCAGCTAAG ACTTTGTGTG CTGGTGTTTT501 GCAAGGTGGT ATTGATACTT GTGGTGGTGA TTCTGGTGGT CCATTGATTT551 GTAACGGTCA ATTTCAAGGT ATTTTGTCTT GGGGTTCTGA TCCATGTGCT601 GAACCAAGAA AGCCAGCTTT TTACACTAAG GTTTTTGATT ACTTGCCATG651 GATTCAATCT ATTATTGCTG GTAACAAGAC TGCTACTTGT CCASEQ-4序列的資料(1).序列特徵a.長度26胺基酸b.類型胺基酸c.拓撲學線性(2).分子類型信號肽(3).序列描述SEQ-41 MVLIRVIANL LILQVSYAQK SSELKR
SEQ-5序列的資料(1).序列特徵a.長度78bpb.類型核甘酸c.拓撲學線性(2).分子類型人工合成的DNA(3).序列描述SEQ-51 ATGGTTTTGA TTAGAGTTAT TGCTAACTTG TTGATTTTGC AAGTTTCTTA51 CGCTCAAAAG TCTTCTGAAT TGAAGAGA
權利要求
1.一種採用基因重組的方法，由酵母、CHO細胞等產生的糖基化或部分糖基化的巴曲酶，它具有使含抗凝劑的動物血漿凝固的特性；
2.權利要求1中所述巴曲酶的胺基酸序列(SEQ-1)與Bothrops atrox毒液中巴曲酶(Batroxobin)胺基酸序列相同，但其分子的糖基化等修飾具有酵母或哺乳動物細胞的特點，且這類修飾是其生物活性所必須的；
3.權利要求1中所說的抗凝劑包括肝素、EDTA、檸檬酸鹽、草酸鹽、水蛭肽和水蛭素等；
4.根據權利要求2，依據Bothrops atrox巴曲酶的胺基酸序列，選擇酵母和大腸桿菌都比較偏好的密碼子，人工合成的巴曲酶結構基因序列SEQ-2以及由酵母喜好的密碼子所組成的巴曲酶結構基因序列SEQ-3；
5.根據權利要求4，將人工合成的巴曲酶基因插入至不同的表達載體中，在酵母、哺乳動物細胞或大腸桿菌中實現分泌表達或胞內表達；
6.根據權利要求5，人工合成的巴曲酶基因能夠在甲醇酵母工程菌(菌種保藏號CCTCC NoM203006)中，以分泌表達的方式大量產生有生物學活性的巴曲酶；
7.根據權利要求5，人工合成的巴曲酶基因也能夠在CHO細胞或其他哺乳動物細胞中，以分泌表達的方式大量產生有生物學活性的巴曲酶；
8.根據權利要求6，巴曲酶在酵母中分泌表達時可以利用酵母的α-信號肽，PHO1信號肽，也可以利用Bothrops atrox巴曲酶的天然信號肽序列(SEQ-4)，其中信號肽序列與巴曲酶蛋白之間插入了KEX2蛋白酶識別序列；
9.權利要求8中的Bothrops atrox巴曲酶信號肽所對應的多核苷酸序列(SEQ-5)是用甲醇酵母Pichia pastoris所喜好的密碼子人工合成的；
10.根據權利要求4、6、7、9，人工合成的巴曲酶基因和Bothrops atrox巴曲酶信號肽中所用的密碼子不僅僅只限於序列SEQ-2、SEQ-3和SEQ-5中所選用的密碼子，而且還包括不會改變巴曲酶蛋白和其信號肽一級結構的所有同義密碼子；
11.根據權利要求6、7，發酵上清液中的巴曲酶以有活性和無活性兩種形式存在，含有Na2HPO4-NaH2PO4、Histidine、GSH(還原型穀胱甘肽)和GSSG(氧化型穀胱甘肽)等成分的溶液有助於無活性巴曲酶蛋白轉變為有活性的巴曲酶；
12.權利要求10中的GSH與GSSG的比例對活性巴曲酶的結構形成非常關鍵，實際操作中GSH的濃度在0.1～10mM範圍，而GSSG的濃度在10～0.1mM範圍的適當組合有利於巴曲酶正確結構的形成；
13.根據權利要求6、7，將發酵上清液進行稀釋或超濾脫鹽等預處理後，先經過陽離子交換介質(如，Mono-S、SP-Sepharose等)，再經過陰離子交換介質(如，Mono-Q、Q-Sepharose等)，最後再進行一步凝膠過濾層析就可以製備出巴曲酶純品；
14.根據權利要求13，純化製備的巴曲酶可作為一種止血藥的主要成分，也可以直接作為降纖維藥之用。
全文摘要
本發明涉及一種基因重組方法製備的巴曲酶(Batroxobin)，其關鍵是巴曲酶基因的合成、表達以及表達產物的純化製備和性質確定。這種重組的巴曲酶既可以作為一種止血藥的主要成分，也可以直接用作降纖藥物。
文檔編號C12N1/19GK1534093SQ0311605
公開日2004年10月6日 申請日期2003年3月28日 優先權日2003年3月28日
發明者黃秀東, 陳佩新, 肖建國, 阮振興, 曾強松, 潘學工, 曹之舫 申請人:上海萬興生物製藥有限公司