砷診斷/測定試劑盒及砷濃度測定方法
2023-07-26 12:10:11 1
專利名稱：砷診斷/測定試劑盒及砷濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種砷診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定砷濃度 的方法，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
砷普遍存在，特別在自然界的開放水域，海洋食品中含有相當高的砷，
高達200mg/kg。典型的歐洲餐食每日砷攝入通常為10mg。砷很快各自經 腸道和肺完全吸收。有毒砷化合物包括砷(三氧化砷)和無色氣體砷都非 常毒，具有大蒜臭味，毒性劑量5 50mg之間，致命劑量〉50mg。大部分 情況下砷從血液到尿液以代謝形式排除，小部分在各組織與巰基團反應， 抑制SH-依賴性酶和物質。
檢測方法有用無火焰氫化物技術原子吸收分光光度法。中子活性分 析是最穩定精確方法，因為它不需預處理樣本且檢測範圍非常低，但不是 一般實驗室具備這樣的檢測能力。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測還 原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測 定砷濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的砷診斷/測定 試劑盒，採用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分
析儀上進行砷濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實 的推廣應用。
本發明砷濃度測定方法原理如下-
蔗糖+磷酸根蔗糖磷酸化酶/As果糖+葡萄糖-l-磷酸 果糖+還原型輔酶甘露醇2-脫氫酶甘露醇+輔酶
這種方法應用需要砷激活的蔗糖磷酸化酶(Disaccharide phosphorylases ; EC 2.4.1.7)酶(偶)聯甘露醇2-脫氫酶(mannitol dehydrogenase ; EC 1.1.1.67 ; EC 1.U.138)酶促反應速率比色法。蔗 糖磷酸化酶酶解蔗糖產生果糖，再通過(偶)聯合甘露醇2-脫氫酶的作 用，最終將還原型輔酶(在340nrn處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm 處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速 度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算砷的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明砷診斷/測定試劑盒 較為理想
磷酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
蔗糖 20 mmol/L
蔗糖磷酸化酶 10000 U/L
甘露醇2-脫氫酶 8000 U/L
本發明的砷診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘
露醇2-脫氫酶。
試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液 體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、蔗糖、磷酸根。 試劑2
緩衝液、穩定劑、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶。 還原型輔酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶在試劑 l或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶 解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩衝液、穩定劑、還原型輔酶。 試劑2
緩衝液、蔗糖、磷酸根。 試劑3
緩衝液、穩定劑、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶。 還原型輔酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶在試劑 1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用 前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定砷濃度的方法，其還原型輔
酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的砷診斷/測定試劑為單試劑，包括-
磷酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
蔗糖 20 mmol/L
蔗糖磷酸化酶 10000 U/L
甘露醇2-脫氫酶 8000 U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使 用前，加入純淨水，復溶後使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸 光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測砷樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1 分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出砷的濃度大 小。
實施例二
本實施例的砷診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑l
磷酸緩衝液
穩定劑
還原型輔酶
函mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 10 mmol/L
試劑2
磷酸緩衝液 穩定劑
蔗糖磷酸化酶 甘露醇2-脫氫g
100 mmol/L
50 mmol/L
16000 U/L
12000U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始吸
光度1.8土0.7，測試主波長340nm,測試副波長405nm，被測砷樣品與試
劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延
遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分
析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出砷的濃度大
實施例三
本實施例的砷診斷/測定試劑為三試劑，包括: 試劑1
磷酸緩衝液
穩定劑
還原型輔酶
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
試劑2
磷酸緩衝液
100 mmol/L
30 mmol/L
試劑3
磷酸緩衝液 穩定劑
蔗糖磷酸化酶 甘露醇2-脫氫酶
100 mmol/L 50 mmol/L 20000 U/L 18000U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定砷濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10 分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340證，測試副波長405nm，被 測砷樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為 負反應(下降反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出砷的濃度大
申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類
同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，便於推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的砷濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" top= "38" left = "37"/>將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出砷的濃度大小測定結果。
2.-種砷診斷/測定試劑盒，主要成分包括磷酸緩衝液 20-穩定劑 卜還原型輔酶 O.l—500 mmol/L 50 mmol/L10.35 mmol/L -50 mmol/L1000-勵0一-80000 U/L -80000 U/L蔗糖磷酸化酶 甘露醇2-脫氫酶其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也 可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述砷診斷/測定試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘 露醇2-脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述砷診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、蔗糖、磷酸根組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、蔗糖磷酸化酶、 甘露醇2-脫氫酶組成。還原型輔酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、 甘露醇2-脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述砷診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘 露醇2-脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、還原型輔 酶組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、蔗糖、磷酸根組成；試劑3，由 緩衝液、穩定劑、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶組成。還原型輔酶、 蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述砷診斷/測定試劑盒，其特徵在於還包括穩定 劑1000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的砷診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定砷濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、還原型輔酶、蔗糖、磷酸根、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出砷的濃度大小。採用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果。
文檔編號G01N33/84GK101169446SQ200610097228
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優先權日2006年10月24日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司