一種載抗腫瘤小分子幹擾rna磁性納米探針的製備方法

2023-07-26 12:57:56 1

專利名稱：一種載抗腫瘤小分子幹擾rna磁性納米探針的製備方法
技術領域：
本發明屬於抗腫瘤小分子幹擾RNA載體、癌症基因治療、核磁共振成像和分子靶 向領域。具體涉及一種載抗腫瘤小分子幹擾RNA磁性納米探針的製備方法。
背景技術：
抗腫瘤小分子幹擾RNA(簡稱siRNA)是一種具有21 25核苷酸序列的小RNA分 子，由Dicer (RNAase III家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶)的ATP依賴性RNA酶切割雙 鏈RNA所形成。siRNA形成之後，與一系列特異性蛋白結合形成siRNA誘導幹擾複合體，此 複合體通過鹼基互補配對識別靶mRNA並使其降解，從而導致特定基因沉默。癌症的發生可以看作是一種基因的疾病，即某些原癌基因被一些特殊的內源或外 源性的因子所激活，從而引起的細胞的各種形態學和生理生化的轉變，進行非機體控制的 持續分裂增殖，最終耗竭機體導致死亡。癌症的基因治療是繼手術、化療、放療後的新型治 療手段，它利用基因轉移技術將正常或野生型等外源基因導入宿主細胞，直接修復或糾正 腫瘤相關基因的結構與功能缺陷，或者阻斷癌症基因的表達，從而誘導腫瘤細胞凋亡。腫瘤靶向治療是針對導致細胞惡性轉化的環節，使用某些能與這些靶分子特異結 合的抗體、配體等，定向引導治療藥物至腫瘤靶部位，從而在分子水平逆轉該惡性生物學行 為，抑制腫瘤細胞生長。目前已有貝伐單抗、曲妥單抗、阿侖單抗、西妥昔單抗、託西莫單抗 等多種抗體被美國食品和藥物管理局(FDA)批准應用於靶向抗腫瘤治療。分子影像學是利用現有的一些醫學影像技術對人體內部生理或病理過程在分子 水平上進行無損傷的、實時的成像，是將分子生物學技術和現代醫學影像學相結合的產物。 其中核磁共振成像具有極高的空間分辨力和組織分辨力，是分子影像學中的重要研究手 段。核磁共振分子成像能夠對腫瘤進行早期及特異性的診斷，並能監測抗腫瘤治療的效果。 構建具有腫瘤的分子成像與治療共同作用的靶向納米分子探針是癌症診斷與基因治療領 域的研究熱點。

發明內容
本發明提供了一種載抗腫瘤SiRNA磁性納米探針的製備方法。用於靶向傳遞抗腫 瘤siRNA至目標靶點，實現腫瘤的基因治療，並同時攜帶超順磁性四氧化三鐵納米顆粒，可 利用核磁共振成像技術特異性診斷和實時監測腫瘤治療效果。本發明的磁性納米探針是這樣實現的首先將水溶性超順磁性四氧化三鐵納米顆 粒和siRNA通過靜電作用相互結合形成複合物，然後採用復乳化法將複合物包載於羧基封 端的聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物(簡稱PLGA-C00H)中製備納米粒，再通過碳二亞胺法 連接上單克隆抗體，最終獲得載抗腫瘤siRNA的磁性納米探針。具體包括以下步驟(1)將抗腫瘤小分子幹擾RNA溶於DEPC水中，加入乙醯化小牛血清白蛋白或低分 子量肝素鈉混勻，加入水溶性超順磁性四氧化三鐵納米顆粒中，4°C冰箱孵育lh，形成水相 複合物；
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(2)將羧基封端的聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物溶於二氯甲烷中，加入上述水相復 合物，形成初乳後溶於聚乙烯醇的DEPC水溶液中，揮去有機溶劑，離心，超濾，水洗3 5次 得到納米粒溶液；(3)將上述納米粒溶液濃縮，加入pH = 5的2-嗎啉乙磺酸溶液活化，超濾，溶於 PH = 7. 4的PBS緩衝液中，加入N-羥基琥珀醯亞胺和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯 二亞胺鹽酸鹽，孵育池，加入單克隆抗體，4°C冰箱孵育過夜，脫鹽柱純化，得載抗腫瘤小分 子幹擾RNA的磁性納米探針。本發明所述DEPC水為焦碳酸二乙酯處理的超純水，所用器皿經焦碳酸二乙酯處理。本發明所述低分子量肝素鈉的平均分子量小於8000道爾頓。本發明所述水溶性超順磁性四氧化三鐵納米顆粒的粒徑小於50nm，磁飽和強度值 為40 lOOemu/g，水溶液中分散後表面電荷呈陽性。本發明所述單克隆抗體為貝伐單克隆抗體、曲妥單克隆抗體、阿侖單克隆抗體、西 妥昔單克隆抗體或託西莫單克隆抗體。本發明所述載抗腫瘤小分子幹擾RNA磁性納米探針具有抑制腫瘤細胞生長的作用。本發明所述載抗腫瘤小分子幹擾RNA磁性納米探針可以作為造影劑，應用於實時 監測腫瘤病變和治療中的變化情況。本發明與現有技術相比，具有如下有益效果1.採用帶正電荷的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米顆粒與帶負電荷的乙醯化白 蛋白或低分子量肝素鈉稀釋的抗腫瘤siRNA通過靜電吸引方式結合，形成的複合物穩定性 好；2.採用羧基封端修飾的聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物作為高分子基包載物，使得 所製備的納米粒表面具有可化學鍵接的活性位點；3.採用碳二亞胺法在納米粒表面連接單克隆抗體，使整個納米探針具有較高的特 異性識別作用；4.通過本發明製備的納米探針既可傳遞抗腫瘤siRNA用做腫瘤基因治療，又可同 時攜帶超順磁性納米粒子進入腫瘤部位，方便腫瘤的分子影像診斷與實時檢測腫瘤治療效


圖1為本發明實施例3在作用4 後，利用MTT法檢測的對腫瘤細胞的抑制率結
具體實施例方式以下的實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實施例1取IOD的抗腫瘤siRNA溶於50 μ L焦碳酸二乙酯(簡稱DEPC)水中，加入50 μ L 質量濃度10%的乙醯化小牛血清白蛋白，混勻器上渦旋震蕩ailin，加入100 μ L 10mg/mL的水溶性超順磁性四氧化三鐵(簡稱USPI0)納米粒子的DEPC水溶液，4°C冰箱孵育Ih得 SPIO-siRNA 複合物。取IOmg PLGA-C00H溶於2mL 二氯甲烷中，加入SPIO-siRNA複合物，超聲30秒， 形成油包水型初乳，在超聲的條件下，將初乳慢慢滴加到30mL質量分數2 %的聚乙烯醇 (簡稱PVA)的DEPC水溶液中，揮去有機溶劑，2500rpm離心去除大顆粒雜質，6000rpm 超濾管離心(濾膜截留分子量為20kDa)去除PVA乳化劑，水洗3 5次，得納米粒 SP10-s i RNA-PLGA-C00H。將上述SPIO-siRNA-PLGA-COOH納米粒溶液濃縮至 ImLJnAlOmL 0. lmol/L pH為 5的2-嗎啉乙磺酸溶液活化lOmin，超濾離心2次，納米粒重分散於5mL pH = 7. 4的PBS 緩衝液中，加入NHS和EDC各100 μ g，孵育2h，加入50 μ L貝伐單抗(AbAvastin)，4°C冰箱孵 育過夜，脫鹽柱(PD-10 Desalting Columns, GE Healthcare, MWCO = 5000Da)純化去除小 分子雜質，得載siRNA的磁性納米探針SPIO-siRNA-PLGA-AbAvastin。實施例2取20D的抗腫瘤siRNA溶於50 μ L DEPC水中，加入50 μ L質量濃度10%的乙醯化 小牛血清白蛋白，混勻器上渦旋震蕩2min，加入100 μ L 10mg/mL的水溶性超順磁性四氧化 三鐵納米粒子的DEPC水溶液，4°C冰箱孵育Ih得SPIO-siRNA複合物。取IOmgPLGA-COOH溶於2mL 二氯甲烷中，加入SPIO-siRNA複合物，超聲30秒，形 成油包水型初乳，在攪拌的條件下，將初乳慢慢滴加到30mL質量分數2%的PVA的DEPC水 溶液中，揮去有機溶劑，2500rpm離心去除大顆粒雜質，6000rpm超濾管離心(濾膜截留分子 量為20kDa)去除PVA乳化劑，水洗3 5次，得納米粒SPI0-siRNA-PLGA_C00H。將上述SPI0-siRNA-PLGA-C00H納米粒溶液濃縮至 ImLJnAlOmL 0. lmol/L pH為 5的2-嗎啉乙磺酸溶液活化lOmin，超濾離心2次，納米粒重分散於5mL pH = 7. 4的PBS 緩衝液中，加入NHS和EDC各100 μ g，孵育2h，加入50 μ L曲妥單抗(Ablteeeptin)，4°C冰箱孵 育過夜，脫鹽柱(PD-10 Desalting Columns, GE Healthcare, MWCO = 5000Da)純化去除小 分子雜質，得載siRNA的磁性納米探針SPI0-siRNA-PLGA-AbHerceptin。實施例3取20D的抗腫瘤siRNA溶於50 μ L DEPC水中，加入50 μ L質量濃度10%的低分子 量肝素鈉，混勻器上渦旋震蕩2min，加入100 μ L 10mg/mL的水溶性超順磁性四氧化三鐵納 米粒子的DEPC水溶液，4°C冰箱孵育Ih得SPIO-siRNA複合物。取20mg PLGA-C00H溶於2mL 二氯甲烷中，加入SPIO-siRNA複合物，超聲30秒， 形成油包水型初乳，在超聲的條件下，將初乳慢慢滴加到50mL質量分數1 %的PVA的DEPC 水溶液中，揮去有機溶劑，2500rpm離心去除大顆粒雜質，6000rpm超濾管離心(濾膜截留 分子量為20kDa)去除PVA乳化劑，水洗3 5次，重分散於IOmL DEPC水中，得納米粒 SP10-s i RNA-PLGA-C00H。取5ml 上述 SPI0-siRNA-PLGA-C00H 納米粒溶液濃縮至 lmL，加入 IOmL 0. Imol/ LpH = 5的2-嗎啉乙磺酸溶液活化lOmin，超濾離心2次，納米粒重分散於5mL pH = 7. 4 的PBS緩衝液中，加入NHS和EDC各100 μ g，孵育2h，加入50 μ L託西莫單抗(Ab麗)，4°C冰 箱孵育過夜，脫鹽柱(PD-10 Desalting Columns, GE Healthcare, MWCO = 5000Da)純化去 除小分子雜質，得載siRNA的磁性納米探針SPI0-siRNA-PLGA-AbTMM。
實施例4對本發明製備的磁性納米探針進行抗腫瘤藥效學試驗肺癌細胞系似49、肝癌細胞系H印G2和胃癌細胞系SGC7901在含15%胎牛血清 (Fetal Bovine Serum，簡稱FBS)的DMEM完全培養基(GIBC0公司，美國)培養，培養條件 為37°C，5% CO2培養箱中溼潤培養。將4. 0 X IO4ceIVcm2細胞接種於96孔板，孵育24h使細 胞貼壁後，設立空白對照組、載抗腫瘤小分子幹擾RNA磁性納米探針處理組和陰性對照組， 每組平行設3個復孔。孵育44h後棄去上清培養液，每孔加入20 μ L新配製的5g/L 3-(4, 5-二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽(簡稱MTT)，孵育4h，移去上清液，加入150 μ L 二甲基亞碸溶解，混勻後用酶標儀在490nm波長處測定吸光度，計算腫瘤細胞抑制率。圖1為作用4 後MTT法檢測的對腫瘤細胞的抑制率結果。結果顯示，經過本發 明載抗腫瘤小分子幹擾RNA磁性納米探針作用後的肺癌細胞系AM9、肝癌細胞系HepG2和 胃癌細胞系SGC7901的分裂明顯減少，細胞生長受到明顯抑制，載抗腫瘤小分子幹擾RNA磁 性納米探針在0 60 μ M對腫瘤細胞系的抑制作用逐漸增強。
權利要求
1.一種載抗腫瘤小分子幹擾RNA磁性納米探針的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)將抗腫瘤小分子幹擾RNA溶於DEPC水中，加入乙醯化小牛血清白蛋白或低分子量 肝素鈉混勻，加入水溶性超順磁性四氧化三鐵納米顆粒中，4°C冰箱孵育lh，形成水相複合 物；(2)將羧基封端的聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物溶於二氯甲烷中，加入上述水相複合 物，形成初乳後溶於聚乙烯醇的DEPC水溶液中，揮去有機溶劑，離心，超濾，水洗3 5次得 到納米粒溶液；(3)將上述納米粒溶液濃縮，加入pH= 5的2-嗎啉乙磺酸溶液活化，超濾，溶於pH = 7. 4的PBS緩衝液中，加入N-羥基琥珀醯亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞 胺鹽酸鹽，孵育池，加入單克隆抗體，4°C冰箱孵育過夜，脫鹽柱純化，得載抗腫瘤小分子幹 擾RNA的磁性納米探針。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述DEPC水為焦碳酸二乙酯處理的 超純水，所用器皿經焦碳酸二乙酯處理。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟(1)所述低分子量肝素鈉的平均 分子量小於8000道爾頓。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟(1)所述水溶性超順磁性四氧化 三鐵納米顆粒的粒徑小於50nm，磁飽和強度值為40 lOOemu/g，水溶液中分散後表面電荷 呈陽性。
5.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟(3)所述單克隆抗體為貝伐單克 隆抗體、曲妥單克隆抗體、阿侖單克隆抗體、西妥昔單克隆抗體或託西莫單克隆抗體。
6.權利要求1所述的載抗腫瘤小分子幹擾RNA磁性納米探針在抗腫瘤中的應用。
7.根據權利要求1或6所述的載抗腫瘤小分子幹擾RNA磁性納米探針在實時監測腫瘤 病變和治療中的變化情況中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種載抗腫瘤小分子幹擾RNA磁性納米探針的製備方法，包括以下步驟將超順磁性四氧化三鐵納米顆粒和抗腫瘤小分子幹擾RNA通過靜電作用相互結合形成複合物，採用復乳法將複合物包載於羧基封端的聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物中製備納米粒，通過碳二亞胺法連接上單克隆抗體獲得磁性納米探針。本發明製備的磁性納米探針可以通過單克隆抗體的特異性介導納米粒進入細胞，所載抗腫瘤小分子幹擾RNA具有較高的轉染效率，可阻斷基因活性，抑制腫瘤細胞分裂，誘導腫瘤細胞凋亡，具有抗腫瘤作用。同時納米探針所載的超順磁性納米顆粒可作為核磁共振成像技術的造影劑，實時監測腫瘤病變和治療中的變化情況。
文檔編號A61K31/713GK102091027SQ201110008658
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月14日 優先權日2011年1月14日
發明者凌友, 魏坤 申請人:華南理工大學