一種利用snp提高白樺細胞中總三萜和齊墩果酸含量的方法
2023-07-29 00:35:21 1
一種利用snp提高白樺細胞中總三萜和齊墩果酸含量的方法
【專利摘要】本發明屬於生物工程領域，具利用體涉及一種利用SNP提高白樺細胞中白樺三萜和齊墩果酸含量的方法。以白樺花葯懸浮細胞為實驗材料，按50g/L接種量接種於100mL?B5液體培養基中，培養條件為：120rpm，25℃，光照強度2000lx，光周期16h，溼度40％～50％，培養周期為10d。培養基成分為B5基本培養基，附加激素及濃度為0.2mg/L6-BA和0.6mg/L?TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白1g/L，pH5.5～6.0，121℃高溫高壓滅菌20min。在細胞懸浮培養第8天加入SNP使其終濃度為1mmol/L，培養12h後收穫，齊墩果酸含量最高為1.3089mg/gDW，是對照組的569％。培養48h收穫，細胞內總三萜含量達到23.86mg/gDW，為對照組的143.20％。該申請發明為解決天然植物藥物來源緊缺和工業化大規模生產白樺三萜和齊墩果酸藥物提供了一種新途徑。
【專利說明】—種利用SNP提高白樺細胞中總三萜和齊墩果酸含量的方法
所屬【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程領域，具體涉及一種利用SNP提高白樺細胞中總三萜和齊墩果酸含量的方法。
【背景技術】
[0002]白樺樹皮中具有重要的三萜類物質，三萜類物質可通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡或者抑制血管生成等方式發揮抗腫瘤作用，此外三萜類物質還有抗炎、抗病毒的作用。隨著三萜化合物生物活性的發現其在醫藥衛生方面的價值逐步顯現，目前已有以齊墩果酸等為主要成分的藥物投入臨床使用。然而，樹木生長周期長，若獲得白樺三萜需對樹木進行砍伐或扒皮，破壞資源，加之其結構複雜，人工方法合成效率低，成本高等因素而成為制約其不能進行臨床大規模應用的主要原因。以細胞全能性為基礎建立起來的植物細胞培養技術為植物藥生產提供了一條新途徑。由於利用植物細胞培養法生產植物天然活性物質具有不受氣候、病蟲害等自然條件的影響，而且不佔用土地，不消耗自然資源，生產周期短和人為可控等優點，因而被認為是解決植物藥生產與天然植物資源可持續發展之間矛盾的一種新型生物技術。大量研究表明NO是植物次生代謝產物合成信號轉導網絡中的關鍵分子，具有重要作用。但目前尚未見使用NO的供體物質SNP促進白樺花葯的愈傷組織和懸浮培養細胞進行合成白樺三萜和齊墩果酸的報導。
【發明內容】
: [0003]為保護白樺自然資源，建立可持續開發利用的資源生產程序，利用來自白樺花葯誘導的愈傷組織和懸浮培養細胞，進行總三萜和齊墩果酸的合成與生產，同時利用高效液相色譜法進行定量檢測。為進行工業化法大規模生產總三萜和齊墩果酸類藥物的提供了新方法。
[0004]技術方案是:在超淨工作檯上，切下雄穗，用70%酒精浸泡5min，再用5%的次氯酸鈉溶液消毒20min，然後放於已滅菌的培養皿中，選擇適宜大小的雄穗，在解剖鏡下用解剖針剝開雄穗，取出花葯，接種到預先經過高溫高壓滅菌的各種組合的培養基上(NT+1.0mg/L 水解酪蛋白 +3%蔗糖 +0.5 ~4.0mg/L2，4_D，0.2 ~4.0mg/L KT)進行愈傷組織的誘導。每瓶接種大約30-35個花葯。先用暗培養一周後進行光培養。培養約7周後，獲得花葯培養愈傷組織。愈傷組織經過繼代培養後，迅速增殖。
[0005]選擇細胞生長速度快，鬆散且總三萜物質含量高的愈傷組織，進行繼代和懸浮培養。並在有利於白樺懸浮細胞生長和次生代謝產物積累的B5+0.1~0.3mg/L6-BA+0.5~1.0mg/L TDZ懸浮培養基中培養細胞系。獲得高產白樺三萜和齊墩果酸懸浮細胞系，經過濾，烘乾，粉碎，有機溶劑(95%乙醇)提取步驟，利用液相色譜方法對白樺酯醇和齊墩果酸檢測和定量分析。
[0006]本專利具有以下特點:[0007]I)生產環境不受地域、季節、水質、病蟲害、氣候等自然環境的影響。
[0008]2)生產周期短，生產過程不產生大量廢渣廢水，安全無汙染，具有生態效益。
[0009]3)培養的白樺懸浮細胞具有生產白樺三萜和齊墩果酸等多種物質的能力，實現了白樺天然植物資源及其藥用成分的開發利用。
[0010]4)利用高效液相色譜方法進行齊墩果酸進行檢測，方法簡單，提取溶劑清潔無毒，操作方便。
[0011]5)為解決抗愛滋病和抗腫瘤天然藥物來源緊缺，加速臨床大規模應用，提供一種新途徑，具有很高的經濟效益和社會效益。
【具體實施方式】
[0012]I)植物材料來源
[0013]白樺取自東北林業大學白樺強化種子園內的開花優樹。選擇雄穗，取出花葯，消毒後接種到預先經過高溫高壓滅菌的各種組合的培養基上(NT+1.0mg/L水解酪蛋白+3%蔗糖+0.5~4.0mg/L2,4-D, 0.2~4.0mg/L KT)進行愈傷組織的誘導。愈傷組織經過繼代培養後，迅速增殖。 挑選生長狀態良好的愈傷組織將其多次繼代後轉移至液體培養基懸浮培養。經過6代以上的轉接，建立穩定的懸浮培養細胞體系，懸浮培養繼代周期為15d，接種量為5g細胞於10mL液體培養基中。
[0014]2)培養條件
[0015]以白樺花葯懸浮細胞為實驗材料，按50g/L接種量接種於10mL B5液體培養基中，培養條件為:120rpm，25°C，光照強度2000Ix，光周期16h，溼度40 %~50 %，培養周期為1d0培養基成分為B5基本培養基，附加激素及濃度為0.2mg/L6-BA和0.6mg/L TDZ,蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L，pH5.5~6.0，121 °C高溫高壓滅菌20min。
[0016]3)誘導子添加
[0017]SNP(Sodium Nitroprusside)購自美國Sigma公司，溶於滅菌蒸懼水中後經
0.22 μ m微孔濾膜過濾，在白樺花葯懸浮細胞培養至第8天時添加入培養基中，終濃度分別為lmmol/L,添加後12h,48h收穫細胞。
[0018]4)總三萜的提取及含量測定
[0019]精密稱取0.05g細胞幹樣，加入2ml95%乙醇並浸泡24h。70°C水浴Ih後再超聲40min，取100 μ L上清液於1ml離心管中並置於70°C水浴蒸乾。加入200 μ L5%香草醛-冰乙酸和800 μ L高氯酸，70°C水浴15min，冰上迅速冷卻。乙酸乙酯定容至5ml後測定其在551nm的吸光值(對照組為200 μ L5%香草醛-冰乙酸+800微升高氯酸+4ml乙酸乙酯)。
[0020]總三萜的標準曲線以齊墩果酸為標準品進行繪製，其回歸方程為y =43.044x-0.6438，相關係數R2 = 0.997，齊墩果酸在4~32mg/L含量範圍內具有良好的線性關係。
[0021]5)齊墩果酸的提取及含量測定
[0022]齊墩果酸的提取參照譚朝陽[80]等的方法，具體方法如下:精密稱取0.5g細胞幹樣，加入25mL鹽酸-乙醇溶液(2: 8)，加熱回流3h，放冷，搖勻並濾過，精密量取續濾液15mL,加蒸餾水15mL，置於80°C水浴上蒸去乙醇，然後用乙醚萃取3次，每次20mL，合併乙醚萃取液並於40°C低溫蒸乾，加Iml甲醇溶解殘渣，並將其用0.45 μ m有機濾膜濾過，此為樣品檢測液，然後利用高效液相色譜進行檢測。
[0023]高效液相色譜(HPLC)檢測條件:用Waters公司600-717-2487色譜系統，色譜柱HiQ sil C18V4.6mmX 250mm ;流動相為乙腈:水=9:1 ;柱溫25V ;靈敏度16AUFS ;流速
1.0mT,/miη ;檢測波長 210nm,進樣 20uL。
[0024]齊墩果酸線性關係考察:精密吸取濃度為0.5mg/mL的齊墩果酸標準品溶液0.2、
0.5、l、2、3、4、5mL，分別置於5mL容量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20 μ L進樣，測定其峰面積積分值。以濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪製標準曲線。齊墩果酸回歸方程為:y = 107x+33446, R2 = 0.9992。結果表明，齊墩果酸在0.2-5.0 μ g範圍內具有良好的線性關係。
[0025]本發明的效果:本發明利用SNP來促進細胞生產的能力，獲得的白樺總三萜和齊墩果酸含量大大提高。由上述技術方案，以白樺花葯懸浮細胞為材料進行實驗，其結果是:SNP處理後，白樺花葯懸浮細胞中齊墩果酸含量為1.3089mg/gDW，是對照組的569%。細胞內總三萜含量達到23.86mg/gDW，為對照組的143.20%。因此，這是一種很有工業應用前景的白樺總三萜和齊墩 果酸的生產方法。
【權利要求】
1.本專利提出NO促進白樺三萜合成技術為:以白樺花葯懸浮細胞為實驗材料，按50g/L接種量接種於10mL B5液體培養基中，培養條件為:120rpm，25°C，光照強度20001x，光周期16h，溼度40%~50%，培養周期為10d。培養基成分為B5基本培養基，附加激素及濃度為 0.1 ~0.3mg/L6-BA 和 0.5 ~4.0mg/L TDZ,蔗糖 20g/L,酸水解酪蛋白 lg/L，ρΗ5.5 ~6.0，121 °C高溫高壓滅菌20min。在細胞懸浮培養第8天加入SNP使其終濃度為lmmol/L，培養12h後收穫，齊墩果酸含量最高為1.3089mg/gDff,是對照組的569 %。培養48h收穫，細胞內總三萜含量達到23.86mg/gDW，為對照組的143.20%。
2.根據權利要求書I所述的方法，其中的液體培養基為為B5基本培養基，附加激素及濃度為0.1~0.3mg/L6-BA和0.5~4.0mg/L TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L。
3.根據權利要求書I所述的方法，其中的白樺花葯細胞接種量為5g鮮細胞含10ml培養液的250ml三角瓶中，搖床轉速120r/min。
4.根據權利要求書I所述的方法， 其中SNP溶液通過0.22um無菌膜過濾除菌，在懸浮培養第八天加入，培養周期為10天，且SNP的終濃度為lmmol/L。
5.根據權利要求書I所述的方法，其中的收穫時間為SNP添加12-24h後收穫懸浮細胞。
6.根據權利要求書I所述的方法，其中SNP處理後齊墩果酸含量最高為1.3089mg/gDff,是對照組的569%。細胞內總三萜含量達到23.86mg/gDff,為對照組的143.20%。
【文檔編號】C12P33/00GK104031970SQ201410260611
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月12日 優先權日:2013年12月22日
【發明者】詹亞光, 曾凡鎖, 辛穎, 劉堃, 齊鳳慧, 範桂枝, 尹靜, 由香玲 申請人:東北林業大學, 詹亞光, 曾凡鎖