農藥環境汙染診斷速測卡及其製造方法
2023-07-22 07:40:56 2
專利名稱：農藥環境汙染診斷速測卡及其製造方法
技術領域：
本發明涉及一種環境汙染速測卡及其製造方法，尤其是一種水環境和無公害農產品中有機磷、氨基甲酸酯類農藥汙染診斷速測卡及其製造方法。屬於診斷檢測用品領域。
背景技術：
有機磷和氨基甲酸酯類農藥是農業上長期使用並對人與動物毒性較強的2類常規農藥。隨著人們生活水平的提高，環境中農藥的殘留，尤其是上述兩類殺蟲劑的殘毒問題受到了普遍關注，傳統的農殘檢測法(氣相和液相色譜法)具有儀器投資大、測試時間長、成本高等缺點，因此，國內外一些學者積極研究和開發用於現場農藥殘留快速檢測的新技術和新方法。農藥速測卡是一種運用膽鹼酯酶抑制法檢測有機磷和氨基甲酸酯類農藥的一種現場快速檢測方法。速測卡法的優點在於簡便、快捷，操作無需培訓，工作效率高、節省人力物力，但目前國產速測卡的缺點在於，反應後的顏色淺，有時不容易判斷。
經文獻檢索發現，1990年《環境科學學報》第10卷第1期《農藥殘毒速測箱的研製和應用》報導了李治祥等人開發的農藥殘留速測箱，該速測箱中除裝有酶片、顯色基質片以外，還有裝有燒杯、塑料管、玻璃棒等，可用於快速檢測蔬菜、水果、糧食及水中的有機磷或氨基甲酸酯類農藥，但是該速測箱的顯色基質片水溶性較差，使用時需以手擠捏促進溶解。國外報導使用的顯色基質片也常存在穩定性等問題。
發明內容
本發明的目的是針對背景技術的不足，提供一種農藥環境汙染診斷速測卡及其製造方法，尤其是涉及水環境和無公害農產品中有機磷、氨基甲酸酯類農藥汙染診斷速測卡及其製造方法，使用這種診斷速測卡，可實現判定結果的及時準確，可靠性、重複性好，從而解決了背景技術中的不足。
本發明的技術方案是這樣實現的，本發明農藥環境汙染診斷速測卡，診斷區、反應區、生色片和基質片組成，可人工摺疊、重合，診斷區在上，反應區在下，診斷區用透明塑料、反應區用特種紙製成，診斷區上載有多片含有固化酶的生色片，其中一個用於參比樣品檢測，其餘則用於可疑樣品檢測，反應區上對應地載有同樣數量的基質片。各生色片、基質片之間均有易撕條，診斷區、反應區上均設有卡口，生色片大小稍大於基質片。速測卡的形狀包括長方形、正方形、圓形、橢圓形等任何幾何形狀。
實施檢測時，在診斷區同時滴加多個可疑樣品，1個參比樣品，3分鐘後，診斷區和反應區緊密接觸，當診斷區對照樣品變色時，觀測比較可疑樣品的顏色變化，不變色的為陽性樣品，否則為陰性樣品。
本發明農藥環境汙染診斷速測卡的製備方法，其步驟如下1、生色片的製備本發明所用酶源為昆蟲勻漿液或動物血清中的乙醯膽鹼酯酶。酶的固定化採用交聯法，用雙功能團試劑(如戊二醛)、牛血清白蛋白和磷酸緩衝液把酶固定到合適的載體上。將物理吸附載體裁成圓片，在4℃以下將乙醯膽鹼酯酶、磷酸緩衝溶液、雙功能試劑、載體蛋白混合，加入物理吸附載體，浸泡15分鐘，然後，取出載體，置於小型通風櫥中陰乾，即為生色片。
其中加入的乙醯膽鹼酯酶與載體的比例為1～5U/片，加入的雙功能團試劑(如戊二醛)與載體的比例為0.2～0.5μl/片，加入的載體蛋白(如牛血清白蛋白)與載體的比例為1～3μl/片。本發明所用載體包括尼龍膜、硝酸纖維膜、醋酸纖維膜或濾紙，優先使用濾紙。使用尼龍膜、硝酸纖維膜、醋酸纖維膜為物理吸附載體時還需增加載體預處理、洗滌保存兩個步驟。
2、基質片的製備將乙醯靛酚溶入乙醇或丙酮中，溶液濃度為400～800mg/l，然後，把物理吸附載體放入該溶液中，浸泡15分鐘，置於小型通風櫥中陰乾，即為基質片。
3、將上述生色片和基質片分別對應地固定在診斷速測卡的診斷區和反應區上，再將成型的15張診斷速測卡和1瓶提取液放入包裝盒內即可。
本發明製備的酶片活性高、穩定性好，特別是在速測卡的結構設計上，採用透明的診斷區，加上參比樣品和可疑樣品合二為一的獨特構思，實現了反應過程的實時觀察，反應色差明顯，結果判定容易，假陽性、假陰性發生率明顯減少。
乙醯膽鹼酯酶是一種蛋白催化劑，通常需要在低溫下保存，試驗證明，保存在0～5℃冰箱中的酶液，1周後活性降低30～50％。當酶活性降低或失去時，酶不能與底物結合而被水解，檢測結果會出現負抑制率。而速測卡是將酶和底物顯色劑固化在紙片上，乾燥後密封，在4℃冰箱中放置1年多後，酶活性和檢測靈敏度測定結果證明，重現性仍很好，幾乎和儲藏前完全相同。
本發明的診斷速測卡穩定性、重複性好、並且不需要特殊儀器，能快速多樣品同時準確診斷出水環境、無公害農產品中的有機磷、氨基甲酸酯類農藥汙染情況，費用低廉，操作簡便、易學，短時間內就能判讀結果，可滿足現場診斷要求，適合於無公害農產品生產基地、環境檢測站大規模檢測使用，也適合於農藥生產廠家、個體經營戶和家庭、菜場自查，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會和生態效益。
圖1為本發明結構示意圖。
圖2為本發明設有三個基質片的結構示意圖。
具體實施例方式
如圖1和圖2所示，本發明農藥環境汙染診斷速測卡由診斷區1、反應區2、生色片3和基質片4組成，診斷區在上，反應區在下，可人工摺疊。診斷區1用透明塑料、反應區2用特種紙製成，診斷區1上載有多片生色片3，其中一個用於參比樣品檢測，其餘則用於可疑樣品檢測。反應區2上對應地載有同樣數量的基質片4，各生色片3、基質片4之間均有易撕條，診斷區1、反應區2上均設有卡口5，生色片3的大小稍大於基質片4。速測卡的形狀包括長方形、正方形、圓形、橢圓形等任何幾何形狀。
如圖1所示，本發明農藥環境汙染診斷速測卡包括診斷區1、反應區2、兩個生色片3、兩個基質片4和卡口5，生色片3固定在診斷區中，基質片4固定在反應區中，診斷區1和反應區2設有標記以示區別，可測試一個樣品。
如圖2所示，與圖1中不同之處在於反應區2設有三個基質片，診斷區1設有三個生色片，可同時測試兩個樣品。
以下通過具體實施例對本發明方法作進一步的詳細描述。
實施例一將濾紙裁成直徑為1Cm和1.5Cm的兩種小圓片，分別用於製作生色片和基質片，在4℃以下將乙醯膽鹼酯酶、戊二醛、牛血清白蛋白分別按1U/片、0.2μl/片、1μl/片的比例與4ml磷酸緩衝液混合，加入載體濾紙，浸泡15分鐘後，取出並置於小型通風櫥中陰乾，即為生色片。製作基質片時可將乙醯靛酚溶入丙酮中，濃度為400mg/l，載體浸泡時間為15分鐘後，置於小型通風櫥中陰乾。將上述生色片和基質片各兩片分別對應地固定在診斷速測卡的診斷區和反應區上，並把成型的15張診斷速測卡和1瓶提取液放入包裝盒內即可。
實施例2將濾紙裁成直徑為1Cm和1.5Cm的兩種小圓片，分別用於製作生色片和基質片在4℃以下將乙醯膽鹼酯酶、戊二醛、牛血清白蛋白分別按3U/片、0.4μl/片、2μl/片的比例與4ml磷酸緩衝液混合，加入載體濾紙，浸泡15分鐘後，取出並置於小型通風櫥中陰乾，即為生色片。製作基質片時可將乙醯靛酚溶入丙酮中，濃度為600mg/l，載體浸泡時間為15分鐘後，置於小型通風櫥中陰乾。將上述生色片和基質片各兩片分別對應地固定在診斷速測卡的診斷區和反應區上，並把成型的15張診斷速測卡和1瓶提取液放入包裝盒內即可。
實施例3將濾紙裁成直徑為1Cm和1.5Cm的兩種小圓片，分別用於製作生色片和基質片在4℃以下將乙醯膽鹼酯酶、戊二醛、牛血清白蛋白分別按5U/片、0.5μl/片、3μl/片的比例與4ml磷酸緩衝液混合，加入載體濾紙，浸泡15分鐘，然後，取出載體，置於小型通風櫥中陰乾，即為生色片。製作基質片時可將乙醯靛酚溶入丙酮中，濃度為800mg/l，載體浸泡時間為15分鐘後，置於小型通風櫥中陰乾。將上述生色片和基質片各兩片分別對應地固定在診斷速測卡的診斷區和反應區上，並把成型的15張診斷速測卡和1瓶提取液放入包裝盒內即可。
實施效果1、樣品處理表面測定法擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴提取液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦，將蔬菜上的液滴滴在速測卡的診斷區生色片上，放置10min後，診斷區和反應區緊密接觸。
整體測定法選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成0.5cm左右見方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入10ml提取液，振搖50次，靜置2min以上，即為待檢液，將2滴待測液滴在速測卡的診斷區生色片上，放置10min後，診斷區和反應區緊密接觸。
環境水樣測定取待測水樣2滴直接滴在速測卡的診斷區生色片上，放置10min後，診斷區和反應區緊密接觸。
當診斷區上含有參比樣品的生色片變色時，觀測比較可疑樣品生色片的顏色變化，不變色的為陽性樣品，否則為陰性樣品。
2、農產品中農藥殘留檢測取自上海三個批發市場的青菜、空心菜、生菜、黃瓜等樣品共25份，編號為1～25，取溫室試驗青菜樣品2份，編號為26、27號。用前述三種方法進行檢測，結果除20、26、27號樣品為陽性樣品外，其餘均為陰性樣品。用氣相色譜法檢測，20號樣品檢出甲胺磷0.8ppm，26號樣品樂果1.2ppm，27號樣品呋喃丹0.5ppm，其餘樣品均未檢出。
3、水中農藥殘留檢測取自江蘇蘇州市郊魚塘水3份，農田水樣1份，編號為1、2、3、4號。用前述三種方法進行檢測，結果1、2、3號為陰性，4號為陽性，用高效液相色譜檢測，4號樣品檢出甲胺磷3.12ppm，1、2、3號樣品未檢出。
上述實例說明，本發明農藥環境汙染診斷速測卡與實驗室色譜分析法有很好的相關性，而且方法的正確度和靈敏度也能達到環境安全的要求，因此，本發明的環境汙染診斷速測卡將有廣闊的應用前景。
權利要求
1.一種農藥環境汙染診斷速測卡，包括生色片(3)、基質片(4)，其特徵在於還包括診斷區(1)、反應區(2)，診斷區(1)用透明塑料、反應區(2)用紙製成，診斷區(1)在上，反應區(2)在下，診斷區(1)上載有多片生色片(3)，反應區(2)上對應地載有同樣數量的基質片(4)，診斷區(1)、反應區(2)上均設有卡口(5)，各生色片(3)、基質片(4)之間均有易撕條，生色片(3)大小稍大於基質片(4)。
2.根據權利要求1所述的農藥環境汙染診斷速測卡，其特徵是，速測卡的形狀包括長方形、正方形、圓形和橢圓形。
3.一種農藥環境汙染診斷速測卡的製造方法，其特徵在於，方法步驟如下(1)生色片的製備採用酶源為昆蟲勻漿液或動物血清中的乙醯膽鹼酯酶，酶的固定化採用交聯法，用雙功能團試劑、牛血清白蛋白和磷酸緩衝液把酶固定到載體上，即為生色片；(2)基質片的製備將乙醯靛酚溶入乙醇或丙酮中，然後，把物理吸附載體放入該溶液中浸泡，置於小型通風櫥中陰乾，即為基質片；(3)將上述生色片和基質片分別對應地固定在診斷速測卡的診斷區和反應區上，再將成型的診斷速測卡和提取液放入包裝盒內即可。
4.根據權利要求3所述的農藥環境汙染診斷速測卡的製造方法，其特徵是，所述的步驟(1)，具體如下將物理吸附載體裁成圓片，在4℃以下將乙醯膽鹼酯酶、磷酸緩衝溶液、雙功能試劑、載體蛋白混合，加入物理吸附載體，浸泡15分鐘，然後，取出載體，置於小型通風櫥中陰乾，即為生色片。
5.根據權利要求3或4所述的農藥環境汙染診斷速測卡的製造方法，其特徵是，加入的乙醯膽鹼酯酶與載體的比例為1～5U/片，加入的雙功能團試劑戊二醛與載體的比例為0.2～0.5μl/片，加入的牛血清白蛋白與載體的比例為1～3μl/片。
6.根據權利要求3或4所述的農藥環境汙染診斷速測卡的製造方法，其特徵是，物理吸附載體採用尼龍膜、硝酸纖維膜、醋酸纖維膜或濾紙，優先使用濾紙，使用尼龍膜、硝酸纖維膜、醋酸纖維膜為物理吸附載體還需增加載體預處理、洗滌保存兩個步驟。
7.根據權利要求3所述的農藥環境汙染診斷速測卡的製造方法，其特徵是，所述的步驟(2)中，將乙醯靛酚溶入乙醇或丙酮中，溶液濃度為400～800mg/l，物理吸附載體放入該溶液中浸泡時間為15分鐘。
8.根據權利要求3所述的農藥環境汙染診斷速測卡的製造方法，其特徵是，所述的步驟(3)中，放入包裝盒內的成型的診斷速測卡為15張，提取液為1瓶。
全文摘要
一種農藥環境汙染診斷速測卡及其製造方法，屬於診斷檢測用品領域。速測卡的診斷區用透明塑料、反應區用紙製成，診斷區在上，反應區在下，診斷區上載有多片生色片，反應區上對應地載有同樣數量的基質片。方法如下採用的酶源為昆蟲勻漿液或動物血清中的乙醯膽鹼酯酶，酶的固定化採用交聯法，用雙功能團試劑、載體蛋白及其磷酸緩衝液把酶固定到載體上，即為生色片；將乙醯靛酚溶入乙醇或丙酮中，然後，把物理吸附載體放入該溶液中浸泡，置於小型通風櫥中陰乾，即為基質片；將生色片和基質片分別對應地固定在診斷區和反應區上，再將成型的診斷速測卡和提取液放入包裝盒內即可。
文檔編號G01N21/77GK1540320SQ20031010826
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月30日 優先權日2003年10月30日
發明者陸貽通, 沈國清, 周培, 洪靜波 申請人:上海交通大學