一種釀酒酵母工程菌生產β-香樹脂醇的方法

2023-07-29 18:49:51 2

一種釀酒酵母工程菌生產β-香樹脂醇的方法
【專利摘要】本發明提供了一種釀酒酵母工程菌生產β-香樹脂醇的方法，屬於生物化工領域。本發明從白色念珠菌中克隆2,3-氧化鯊烯單氧酶基因，化學合成經密碼子優化的光果甘草β-香樹脂醇合酶基因，利用釀酒酵母組成型啟動子構建基因表達盒，與雙酶切後的質粒共同轉化釀酒酵母，通過釀酒酵母的同源重組功能實現基因表達盒與質粒的組裝，從而強化了2,3-氧化鯊烯單氧酶並導入了β-香樹脂醇合酶。本發明的釀酒酵母工程菌代謝葡萄糖直接合成β-香樹脂醇，β-香樹脂醇的合成與釀酒酵母生長耦合，實現了植物次生代謝產物β-香樹脂醇的釀酒酵母人工合成，該方法不需要效應劑誘導、工藝簡單，可用於發酵生產β-香樹脂醇。
【專利說明】一種釀酒酵母工程菌生產β-香樹脂醇的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種釀酒酵母工程菌的構建及發酵生產β-香樹脂醇的方法，屬於生物化工領域。【背景技術】
[0002]萜類是一類具有特殊價值的植物次生代謝產物，在抵禦感染、紫外輻射、乾旱等生物和非生物脅迫方面具有重要功能，許多萜類物質顯示出抵禦人類疾病的藥物活性。甘草酸是中國傳統藥用植物甘草的最重要萜類化合物，具有抗感染、抗炎、抗潰瘍、抗病毒和防治腫瘤等多方面的作用。β -香樹脂醇是甘草酸生物合成的重要前體物，不僅具有與甘草酸相似的生物功能，還在抗高血壓和降血脂等方面具有特殊作用。但由於β_香樹脂醇在甘草中的積累量很少，直接提取工藝複雜、能耗高、且生產周期長，而複雜的分子結構使其化學合成也難以實現。利用微生物發酵方法生產β_香樹脂醇生長周期短、過程可控，能夠緩解對甘草資源的依賴，具有可觀的經濟效益和綠色環保的社會效益。
[0003]β -香樹脂醇經萜類共同合成途徑的中間產物鯊烯，通過2，3-氧化鯊烯單氧酶和β -香樹脂醇合酶催化形成。由於2，3-氧化鯊烯單氧酶在微生物細胞內的比活力很低，且其催化產物2，3-氧化鯊烯具有多個分支代謝，被認為是植物三萜生物合成途徑中的關鍵限速酶之一。另外，在微生物中還未發現β_香樹脂醇合酶，因此，異源表達β_香樹脂醇合酶是實現微生物合成香樹脂醇的必要條件。
[0004]在微生物體系中，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由於自身次生代謝途徑有限，因而對外源途徑的競爭或幹擾較少，且釀酒酵母的代謝途徑與基因組信息清楚，認為是合成植物次生代謝產物的優秀潛在宿主。通過強化2，3-氧化鯊烯單氧酶的表達和引入β -香樹脂醇合酶實現釀酒酵母生產植物天然產物β -香樹脂醇，將為植物天然產物的微生物高效合成提供技術支持。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是為解決β -香樹脂醇在甘草中積累量低和化學法難以合成的局限，提供一種利用釀酒酵母工程菌生產β -香樹脂醇的方法。
[0006]為達到上述目的，本發明的技術方案提供一種釀酒酵母工程菌的構建，從白色念珠菌CGMCC2.2086 (Candida albicans)中克隆2，3-氧化鯊烯單氧酶SQE基因片段，化學合成光果甘草(Glycyrrhiza glabra)中的β _香樹脂醇合酶bAS基因片段,從釀酒酵母INVScl中分別克隆組成型啟動子TYSlp、FBAlp和終止子TYSlt、FBAlt，然後通過重疊延伸PCR構建2，3-氧化鯊烯單氧酶基因表達盒TYSlp-SQE-TYSlt和β -香樹脂醇合酶基因表達盒FBAlp-bAS-FBAlt，與Sal I和BamH I雙酶切後的pRS41H質粒共同轉入釀酒酵母INVScl中，通過釀酒酵母自身的同源重組實現兩個基因表達盒和質粒的連接，以質粒形式存在。
[0007]本發明的釀酒酵母工程菌，為INVScl/pRS41H-(TYSlp-SQE-TYSlt) - (FBAlp-bAS-FBAlt) ， 在其中強化表達了 2，3-氧化鯊烯單氧酶和導入了 β_香樹脂醇合酶。[0008]本發明的釀酒酵母工程菌能夠發酵生產β -香樹脂醇，實現了 β -香樹脂醇的釀酒酵母合成。本發明的釀酒酵母工程菌，具有以下優點:
[0009]1、本發明構建的釀酒酵母工程菌，通過釀酒酵母自身的同源重組功能實現基因表達盒和質粒的連接，與傳統的限制性酶切、連接組裝方法相比，不需要酶切和連接反應，基因操作容易，基因組裝過程高效。
[0010]2,2, 3-氧化鯊烯單氧酶和β -香樹脂醇合酶分別受組成型啟動子TYSlp和FBAlp控制，β -香樹脂醇的合成與釀酒酵母生長耦合，不需要效應劑的誘導，簡化了發酵工藝，降低了成本。
[0011]3、本發明的釀酒酵母工程菌代謝葡萄糖直接合成β-香樹脂醇，實現了植物次生代謝產物β -香樹脂醇的釀酒酵母人工合成,最高生產濃度達25.5mg/L。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是本發明實驗例中釀酒酵母工程菌發酵生產β -香樹脂醇的組分分析總離子色譜圖；
圖2是本發明實驗例中釀酒酵母工程菌發酵生產的β-香樹脂醇的質譜圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例，對本發明的【具體實施方式】進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0014]實施例1:釀酒酵母基因工程菌的構建
[0015]1、從白色念珠菌CGMCC2.2086中克隆出2，3_氧化鯊烯單氧酶SQE基因片段，與Genbank公布的白色念珠菌2，3-氧化鯊烯單氧酶基因序列(Genbank註冊序列號為ΑΒ037203)作BLAST比對，同源性分析顯示，克隆的SQE基因片段與Genbank基因庫公布的白色念珠菌2，3-氧化鯊烯單氧酶基因的同源性為100%。
[0016]引物序列為:
[0017]引物1: 5，>GATTAGCATCCATAACCGCATACTCTAATTGACGATAACATGAGTTCAGTTAAGTATGA〈3』 (如SEQ ID N0.1所示)，下劃線序列為與啟動子TYSlp重疊序列。
[0018]引物2:5』 >GCCAAGTAGGCAATTATTTAGTACTGTCAGTATTGTTATCTATCTTACAATCTCGTTCC〈3』 (如SEQ ID N0.2所示)，下劃線序列為與終止子TYSlt重疊序列。
[0019]2、從Genbank基因庫中查詢獲得光果甘草β -香樹脂醇合酶bAS基因片段，利用釀酒酵母密碼子偏好性進行密碼子優化，化學合成後擴增獲得bAS基因片段(如SEQ IDN0.3所示)。
[0020]引物序列為:
[0021 ]引物 3:5，>TTGTCATATATAACCATAACCAAGTAATACATATTCAAAATGTGGAGATTGAAGATCGC〈3』 (如SEQ ID N0.4所示)，下劃線序列為與啟動子FBAlp重疊序列。
[0022]引物4:5 』 >ATACTCATTAAAAAACTATATCAATTAATTTGAATTAACTTAAGTCAAACAAACTGGAG〈3』 (如SEQ ID N0.5所示)，下劃線序列為與終止子FBAlt重疊序列。
[0023]3、從釀酒酵母INVScl中克隆組成型啟動子和終止子基因片段
[0024]從釀酒酵母INVScl中克隆組成型啟動子TYSlp基因片段
[0025]引物序列為:[0026]引物5:5， >CCAATTGCAAAGGGAAAAGCTGAATGGGCAGTTCGAATACCTTGCGCTTACTCGAATAG〈3』 (如SEQ ID N0.6所示)，下劃線序列為與質粒pRS41H重疊序列。
[0027]引物6:5 』 >TGCACCAATAATAATAGCATCATACTTAACTGAACTCATGTTATCGTCAATTAGAGTAT〈3』(如SEQ ID N0.7所示)，下劃線序列為與SQE上遊基因重疊序列。
[0028]從釀酒酵母INVScl中克隆終止子TYSlt基因片段
[0029]引物序列為:
[0030]引物7:5，>ATCTTTACTCCATATTTATGGAACGAGATTGTAAGATAGGCATAGCTTAATCCGTTTTC〈3』(如SEQ ID N0.8所示)，下劃線序列為與SQE下遊基因重疊序列。
[0031 ]引物 8:5 』 >GCCAAGTAGGCAATTATTTAGTACTGTCAGTATTGTTATCAGGATGCTACTATTAAAAT〈3』 (如SEQ ID N0.9所示)，下劃線序列為與FBAlp上遊基因重疊序列。
[0032]從釀酒酵母INVScl中克隆組成型啟動子FBAlp基因片段
[0033]引物序列為:
[0034]引物9:5，>CATTTAACAAAAGCAAACTATTTTAATAGTAGCATCCTGATAACAATACTGACAGTACT〈3』 (如SEQ ID N0.10所示)，下劃線序列為與TYSlt下遊基因重疊序列。
[0035]引物10:5，>TGGGTCCTTCCCTCCTTCCGCTATCTTCAGCCTCCACATTTTGAATATGTATTACTTGG〈3，(如SEQ ID N0.11所示)，下劃線序列為與bAS上遊基因重疊序列。
[0036]從釀酒酵母INVScl中克隆終止子FBAlt基因片段
[0037]引物序列為:
[0038]引物11:5，>AGAGTTCCATTGCCATCTACTCCAGTTTGTTTGACTTAAGTTAATTCAAATTAATTGAT〈3，(如SEQ ID N0.12所示)，下劃線序列為與bAS下遊基因重疊序列。
[0039]引物12:5，>ACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTGCTATCAAAAACGATAGATC〈3，(如SEQ ID N0.13所示)，下劃線序列為與質粒pRS41H重疊序列。
[0040]4、通過重疊延伸PCR構建2，3-氧化鯊烯單氧酶基因表達盒TYSlp-SQE-TYSlt和β-香樹脂醇合酶基因表達盒FBAlp-bAS-FBAlt，與Sal I和BamH I雙酶切後的pRS41H質粒共同電擊轉入釀酒酵母INVScl中，通過釀酒酵母自身的同源重組實現兩個基因表達盒和質粒的連接，外源基因以質粒形式存在，構建釀酒酵母工程菌，具體過程如下:
[0041]利用引物5和引物8，以TYSlp、SQE和TYSlt基因片段為共同模板，通過重疊延伸PCR方法構建2，3-氧化鯊烯單氧酶基因表達盒TYSlp-SQE-TYSlt ；
[0042]利用引物9和引物12，以FBAlp、bAS、FBAlt基因片段為共同模板，通過重疊延伸PCR方法構建β -香樹脂醇合酶基因表達盒FBAlp-bAS-FBAlt ；
[0043]採用Sal I和BamH I雙酶切pRS41H質粒，使其線性化；
[0044]將TYSlp-SQE-TYSlt、FBAlp-bAS-FBAlt基因表達盒和線性化的pRS41H質粒混合後電擊轉化釀酒酵母INVScl，由於基因表達盒和線性化質粒之間彼此具有重疊序列，通過釀酒酵母自身的同源重組功能完成基因表達盒和質粒的組裝連接，形成質粒PRS41H- (TYSlp-SQE-TYSlt) - (FBAlp-bAS-FBAlt)，獲得釀酒酵母轉化子。
[0045]5、釀酒酵母工程菌的鑑定
[0046]將上述電擊轉化後的釀酒酵母INVScl塗布在含有潮黴素B抗性篩選平板上，由於PRS41H質粒含有潮黴素B抗性基因，轉化成功的工程菌株在潮黴素B抗性平板上生長，菌落PCR篩選獲得陽性釀酒酵母工程菌，進一步發酵培養驗證。[0047]實施例2:釀酒酵母工程菌發酵生產β -香樹脂醇的驗證
[0048]挑選實施例1篩選出的釀酒酵母工程菌，在含有2%的葡萄糖、2%蛋白腖和1%酵母粉的培養基中30°C搖瓶培養，5天後5000rpm離心5min，沉澱用IOmL的20%氫氧化鉀溶液(含有50%乙醇)重懸，然後在沸水中煮沸lOmin，室溫冷卻後用正己烷萃取2次，萃取液合併後濃縮至lmL，然後在濃縮液中添加100 μ L嘧啶和50 μ L N，O-雙(三甲基矽基)三氟代乙醯胺，37°C反應2h。利用安裝有Agilent色譜柱DB-1 (30m*0.25mm*0.25um)的島津氣相色譜-質譜聯用儀GCMS-QP2010進行釀酒酵母工程菌發酵生產β -香樹脂醇的分析，組分分析見質譜圖(附圖)，結果說明釀酒酵母工程菌中成功強化了 2，3-氧化鯊烯單氧酶和導入了香樹脂醇合酶，能夠合成香樹脂醇。
[0049]實施例3:釀酒酵母工程菌在發酵生產β -香樹脂醇中的應用
[0050]種子液培養:從平板上挑取經實施例1和2篩選到的釀酒酵母工程菌單菌落，接種於含有2%的葡萄糖、2%蛋白腖和1%酵母粉的40mL培養基中，30 °C、170rpm振蕩培養36h。
[0051]發酵試驗:按照初始吸光值0.1 0的接種量轉接種子液至盛有IOOmL發酵培養基(2%葡萄糖、2%蛋白腖、1%酵母粉，pH7.0)的300mL搖瓶中，30°C、170rpm振蕩培養120h，每24h取樣一次，測定釀酒酵母細胞中β -香樹脂醇的含量，結果顯示，釀酒酵母工程菌發酵結束後β -香樹脂醇含量達到11.1mgfL0
[0052]實施例4:
[0053]如實施例3所述的釀酒酵母工程菌在發酵生產β -香樹脂醇中的應用，不同之處在於:
[0054]發酵試驗中發酵培養基中葡萄糖含量為3%，按照初始吸光值0.10的接種量轉接種子液至盛有IOOmL發酵培養基的搖瓶中，30°C、170rpm振蕩培養120h至發酵結束後，β -香樹脂醇含量達到25.5mg/L。
【權利要求】
1.一種釀酒酵母工程菌的構建，其特徵在於，從白色念珠菌CGMCC2.2086中克隆2，3-氧化鯊烯單氧酶SQE基因，密碼子優化光果甘草中的β -香樹脂醇合酶bAS基因並化學合成，從釀酒酵母INVScl中克隆組成型啟動子TYSlp、FBAlp和終止子TYSlt、FBAlt，然後構建2，3-氧化鯊烯單氧酶基因表達盒TYSlp-SQE-TYSlt和β -香樹脂醇合酶基因表達盒FBAlp-bAS-FBAlt，與雙酶切後的pRS41H質粒共同轉入釀酒酵母INVScl中，利用釀酒酵母的同源重組功能實現兩個基因表達盒和質粒的組裝連接。
2.如權利要求1所述的構建的釀酒酵母工程菌，其特徵在於，所述的釀酒酵母工程菌是 INVScl/pRS41H-(TYSlp-SQE-TYSlt)-(FBAlp-bAS-FBAlt)，在其中強化表達了 2，3-氧化鯊烯單氧酶和導入了 β_香樹脂醇合酶。
3.權利要求1或2所述的釀酒 酵母工程菌在發酵生產β-香樹脂醇中的應用。
【文檔編號】C12N1/19GK103509726SQ201310421102
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月16日 優先權日:2013年9月16日
【發明者】李春, 張根林, 周曉宏, 劉靜竹 申請人:北京理工大學