一種特異性擴增引物及其標記小麥高分子谷蛋白亞基的方法
2023-07-29 01:00:56 1
專利名稱：一種特異性擴增引物及其標記小麥高分子谷蛋白亞基的方法
技術領域：
本發明是一種特異性擴增引物及其標記小麥高分子谷蛋白亞基的方法。
目前用來鑑定小麥高分子谷蛋白亞基的常規方法是種子儲藏蛋白的聚丙稀醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)。這個方法的缺點一是不夠精確，二是必需要等到下一代種子收穫以後才能進行檢測和篩選，大大影了響育種的效率。近年來發展起來的利用亞基特異性引物鑑別小麥高分子谷蛋白的分子標記方法(AS-PCR)被認為是更精確和快速的鑑別方法，它可以在育種早期雜種F1的種子中進行檢測和篩選而不必等到F2代的種子收穫以後再進行。該方法可以大大提高檢測和篩選的效率，加速小麥育種進程，具有很高的實用價值。但是，由於小麥控制高分子谷蛋白基因的高度保守性，使得亞基特異性引物的設計相當困難。因此，目前可用來鑑定小麥高分子谷蛋白亞基的分子標記還很少，還沒有Dxt1.5亞基的特異性引物存在，使該方法的應用受到限制。
本發明的目的是一種基於不同高分子谷蛋白亞基DNA序列的差異，應用PCR技術快速精確檢測小麥中是否含有來源於節節麥高分子谷蛋白亞基Dxt1.5的方法。
本發明的亞基特異性引物共有三類，其中一類(P2)是共用引物。引物對P2+P3用於特異性地擴增Dxt1.5亞基的等位基因，而引物對P2+P4用於特異性擴增Dx2，Dx5，Dxt2和Dxt5的基因位點。
以下列序列為例，三類引物可以如下序列
本發明使用的聚合酶鏈式擴增體系為常規PCR體系，不需要特殊的PCR儀和特殊的反應試劑，任何公司生產的PCR儀和任何生物試劑公司生產的試劑均可以使用而達到目的。
由於本發明使用的反向引物P2位於高分子谷蛋白基因的中間重複區，因此可能在退火時結合到不同的位置，理論上來說最多可能擴增出三條條帶。在本發明的擴增條件下，通常出現一條和兩條擴增條帶，有時也會出現三條條帶。擴增的條帶具有一定的隨機性即同一個樣品在相同條件下，可能會出現不同的帶譜。不過這種隨機性不影響對結果的判斷，當使用特定亞基的特異性引物時進行實驗，只要出現擴增條帶就說明該樣品含有目標亞基。同時，本發明建議最好同時使用兩對亞基特異性引物(P2+P3和P2+P4)進行實驗，這樣可以排除假陰性—即由於PCR反應條件的不適合或者由於某利偶然因素導致擴增失敗，使得具有特定高分子谷蛋白亞基的樣品沒有擴增出相應帶譜的現象。另外，同時使用兩對亞基特異性引物還可以判斷該樣品的編碼高分子谷蛋白亞基的等位基因是純合或是雜合的。例如具有Dxt1.5亞基的純合樣品只能被P2+P3引物對擴增出條帶，具有Dx2，Dx5，Dxt2或Dxt5亞基的純合樣品只能被P2+P4引物對擴增出條帶，而同時具有Dxt1.5亞基和Dx2，Dx5，Dxt2或Dxt5亞基的雜合樣品則能同時被引物對P2+P3和P2+P4擴增出條帶。這在實際育種工作中具有很大的實用價值。
PCR反應條件、程序如下(20ul體系)1×PCR緩衝液2mM Mg0.2mM of each dNTP，1U Ex-Taq DNA polymerase250ng AS-PCR引物(根據權利要求1)DNA模版(適量)加水至20ulPCR程序為1)94℃預變性4分鐘2)94℃變性1分鐘3)退火溫度65℃-71℃，退火時間30-55秒4)72℃延伸1分鐘5)72℃延伸7分鐘循環步驟為2)，3)，4)，40個循環電泳檢測1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。含有節節麥高分子谷蛋白亞基Dxt1.5的樣品在使用權利要求1中引物P2和P3時能擴增出條帶，而在使用權利要求1中引物P2和P4時不能擴增出條帶；含有小麥高分子谷蛋白亞基Dx2，Dx5和節節麥高分子谷蛋白亞基Dxt2，Dxt5的樣品在使用權利要求1中引物P2和P3時不能擴增出條帶，而在使用權利要求1中引物P2和P4時能擴增出條帶。
本發明PCR反應條件中對擴增效果影響最大的是退火溫度由於用於特異性擴增Dxt1.5亞基和其他亞基(Dx2，Dx5，Dxt2和Dxt5)的引物對差異很小，所以為了減少非特異性擴增，採用了相對比較高的退火溫度(退火溫度65℃-71℃，退火時間30-55秒)，這種條件下PCR的反應效率相對較低。因此如果出現沒有擴增條帶的情況，可以降低退火溫度，使反應效率增高。但同時要注意隨著退火溫度的降低，非特異性擴增也會增強，可能會出現假陽性的情況。在使用本發明推薦的PCR反應退火溫度時，可以先使用具有已知的高分子谷蛋白亞基的樣品，這樣可以在增加PCR反應效率的同時防止出現因為退火溫度過低而導致的假陽性現象。
本發明利用亞基特異性引物鑑別小麥高分子谷蛋白亞基設計了三條引物，結構簡明使用方便。基於聚合酶鏈式擴增反應，利用不同高分子谷蛋白亞基的DNA序列差異和PCR反應的快速高效，在短時間內能精確檢測小麥或節節麥的D基因組中是否含有來自於節節麥的高分子谷蛋白亞基Dxt1.5，或者是否含有小麥高分子谷蛋白亞基Dx2，Dx5以及節節麥高分子谷蛋白亞基Dxt2或Dxt5。本發明使用方便，效果快捷明顯，有良好的推廣應用前景。
圖2是實施例1的引物對P2+P3的AS-PCR檢測圖。
圖3是實施例1的引物對P2+P4的AS-PCR檢測圖。
圖4是實施例2的SDS-PAGZ檢測圖。
圖5是實施例2的引物對P2+P3的AS-PCR檢測圖。
圖6是實施例2的引物對P2+P4的AS-PCR檢測圖。
使用反應體系如下PCR反應體系(20ul)1×PCR緩衝液2mM Mg0.2mM of each dNTP，1U Ex-Taq DNA polymerase250ng AS-PCR引物(根據權利要求1)DNA模版(適量)
加水至20ulPCR程序為6)94℃預變性4分鐘7)94℃變性1分鐘8)65℃退火30秒9)72℃延伸1分鐘10)72℃延伸7分鐘循環步驟為2)，3)，4)，40個循環電泳檢測1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
樣品的高分子谷蛋白亞基組成
由上述實驗結果可見，具有Dxt1.5亞基的節節麥用引物P2+P3可以擴增出條帶，而用P2+P4則擴增不出該條帶。具有Dx2，Dx5，Dxt2，Dxt5亞基的節節麥和小麥用引物P2+P4可以擴增出條帶，而用引物P2+P3則擴增不出條帶。AS-PCR分子標記的結果和SDS-PAGE的結果相吻合，表明用該方法可以準確鑑定含有出Dxt1.5亞基的樣品。
使用反應體系如下PCR反應體系(20ul)1×PCR緩衝液2mM Mg0.2mM of each dNTP，1U Ex-Taq DNA polymerase250ng AS-PCR引物(根據權利要求1)DNA模版(適量)加水至20ulPCR程序為11)94℃預變性4分鐘12)94℃變性1分鐘13)71℃退火55秒14)72℃延伸1分鐘15)72℃延伸7分鐘循環步驟為2)，3)，4)，40個循環電泳檢測1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
樣品的高分子谷蛋白亞基組成
由上述實驗結果可見，具有Dxt1.5亞基的小麥重組近交系單株可以用引物對P2+P3擴增出條帶，而用引物對P2+P4則擴增不出條帶。而在該系中，具有其他高分子谷蛋白亞基的小麥單株可以用引物對P2+P4擴增出條帶，而用引物對P2+P3則擴增不出條帶。AS-PCR分子標記的結果和SDS-PAGE的結果完全吻合，AS-PCR分子標記的結果更清楚準確，表明用該方法可以在小麥重組近交系中準確鑑定出含有Dxt1.5亞基的單株。
權利要求
1.一種特異性擴增引物，其特徵是長度是20bp的寡聚核苷酸及其衍生物，序列如下
2.根據權利要求1所述的特異性擴增引物，其特徵是通過聚合酶鏈式擴增反應，用引物對P2+P3能擴增出條帶檢測小麥高分子谷蛋白亞基中有Dxt1.5，用引物對P2+P4能擴增出條帶檢測小麥高分子谷蛋白亞基中有Dx2，Dx5，Dxt2，Dxt5。
3.根據權利要求書2中所述的特異性擴增引物，用現有聚合酶鏈式擴增反應條件，其特徵是退火條件是退火溫度65℃-71℃，退火時間30秒-55秒。
全文摘要
本發明是一種特異性擴增引物及其標記高分子谷蛋白亞基的方法。目前用來鑑定小麥高分子谷蛋白亞基的常規方法是種子儲藏蛋白的聚丙稀醯胺凝膠電泳法，該方法不夠精確，且要下一代種子收穫後才能檢測和篩選，十分影響育種效率。本發明發明了三類引物，基於聚合酶鏈式擴增反應，利用不同高分子谷蛋白亞基的DNA序列差異和PCR反應的快速高效，能準確檢測小麥或節節麥中是否含有來自於節節麥的高分子谷蛋白亞基Dx
文檔編號C07H21/00GK1410433SQ02136960
公開日2003年4月16日 申請日期2002年9月12日 優先權日2002年9月12日
發明者盧寶榮, 陸春明, 楊武雲 申請人:復旦大學