一種從桑黃中提取抗病毒活性物質的方法

2023-07-21 14:44:06

專利名稱：一種從桑黃中提取抗病毒活性物質的方法
一種從桑黃中提取抗病毒活性物質的方法
技術領域：
本發明涉及一種從中藥中提取活性物質的方法。
背景技術：
桑黃屬擔子菌亞門、多孔菌科、木層孔菌屬，又稱桑臣、桑耳、胡孫眼、鮑氏層孔菌、 針裂蹄(裂蹄)，是一種珍貴的藥用真菌，有「森林黃金」之美稱。據《藥性論》記載桑黃味 微苦，性寒。具有利五臟，軟堅，排毒，止血，活血，和胃止瀉的功效。主治淋病，崩漏帶下，症 瘕積聚，癖飲，脾虛洩瀉。在我國傳統中藥中用於治療痢疾、盜汗、血崩、血淋、臍腹澀痛、脫 肛瀉血、帶下、閉經等。在古代，民間就流傳有「桑樹生黃，幸得之，百病可醫」的說法。現代 研究表明，桑黃含有多糖、黑色素、過氧化酶、麥角留醇、芳樟醇、三萜酸、脂肪酸類、芳香酸、 原兒茶醛、丁香酸、咖啡酸、柚皮素、櫻花亭、香豆素等成分。隨著現代分析與檢測方法的不 斷改進及新方法的開發，對桑黃的研究也進入了一個新的階段。已有的研究發現桑黃具有 以下功效1.抗腫瘤沈業壽等的研究表明桑黃胞內多糖有明顯的抗腫瘤作用，並能降低化療藥物造成 的免疫系統損傷。KIm. H. M等發現桑黃菌絲體的胞外多糖能使T細胞增殖，對不同類抗原 的T細胞液有增殖作用。趙瀾等的研究表明桑黃粗多糖能顯著抑制腫瘤細胞的粘附、侵襲 和遷移等腫瘤轉移相關能力，即桑黃粗多糖具有抑制腫瘤細胞增殖及腫瘤轉移的作用。2.保肝抗肝張萬國等研究表明，桑黃可通過抗脂質過氧化和調節炎症因子水平起到保護肝細 胞的作用，並通過改善血液動力學性能，提高肝區微循環起到抗肝纖維化的作用。3.抗誘變與突變Shon研究表明桑黃菌絲體水提物具有抗誘變活性，主要是通過提高醌氧化還原酶 和誘變劑的活性以及誘變水平來抑制腫瘤。4.改善骨髓損傷王中喜等研究表明桑黃多糖對小鼠骨髓造血功能損傷具有保護作用，可較好的改 善動物骨髓損傷。5.抗菌Jong-Moon Hur等研究發現桑黃的正丁醇浸提物能有效的抗耐甲氧基西林金黃色 葡萄球菌，其抗菌機理還需要進一步研究。6.抗氧化Ajith, Τ. A.等研究發現桑黃乙酸乙酯浸提物對超氧陰離子的清除，抗壞血酸引起 油脂氧化的抑制，過氧化物和一氧化氮的清除有很好的效果。7.抗炎症Kim, S. H等發現桑黃正丁醇提取物可以消去由巴豆油引起的小鼠耳朵水腫發炎。 Beom-Su Jang等研究發現桑黃提取物能夠抑制肺炎大鼠炎症細胞包括嗜中性粒細胞的數量及白介素(L)-I β的水平。8.抗血管生成Kim, S. H等研究發現桑黃正丁醇提取物可以強烈抑制胚雞胚絨毛尿囊膜血管生 成。Song Y S等研究也表明桑黃的乙醇提取物包含有效的抗血管生成物質。這些研究讓我 們有理由相信桑黃的抗血管生成作用將會成為癌症治療的輔助性治療。9.降血糖Kim等研究發現桑黃多糖能降低血糖，同時減少總膽固醇、三醯甘油和天冬氨酸轉氨酶。
綜上所述，桑黃在抗腫瘤、護肝、抗炎症、抗誘變與突變、抗氧化、抗菌、降血糖、改 善骨髓損傷、抗血管生成方面有突出功效。但在抗病毒方面的研究卻鮮有報導，本發明主要 對桑黃的抗病毒功效進行研究。

發明內容本發明旨在提供一種從桑黃中提取抗病毒活性物質的方法，其中所獲得的抗病毒 活性物質可以用於預防和輔助治療相關病毒感染疾病。本發明所述的一種從桑黃中提取抗病毒活性物質的方法，由以下步驟組成(1)將桑黃子實體在低溫中進行脫水粉碎；(2)向粉碎後的桑黃子實體中加入其體積2-10倍的乙酸乙酯浸提，並使用超聲波 震蕩，抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥成粉末Α。(3)向乙酸乙酯提取後的濾渣中加入該濾渣2-10倍體積的90%乙醇浸提，並使用 超聲波震蕩，抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥成粉末B。(4)向乙醇提取後的濾渣中加入該濾渣5-30倍體積的20°C水，超聲提取，過濾後 合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥成粉末C。(5)將粉末 A，粉末 B，粉末 C 以10% -80% 10% -80% 10% -80%的質量百 分含量比混合均勻。其中，步驟(1)所述的低溫優選為20°C以下的低溫。步驟(2)中所述的乙酸乙酯浸提，優選為其浸提1-3次，每次1-2小時。步驟(3)中所述的乙酯浸提，優選為其浸提1-3次，每次1-2小時。步驟⑵和(3)中所述的超聲波震蕩時間優選為1-4小時。步驟(4)中所述的超聲提取，優選為其浸提1-4次，每次1-4小時。本發明有效地提取了桑黃中的抗病毒活性物質，並使獲得的活性物質具有較高的 抗病毒功效。通過實驗驗證發現此製劑副作用低，對多種病毒具有良好的抑制效果，且無耐 藥性的產生。下面通過相關實驗來驗證本發明從桑黃中提取獲得的抗病毒活性物質(下面簡 稱為本發明)的功效。使用本發明進行病毒感染細胞實驗。稱取一定量的本發明，用1640培養基稀釋成10mg/ml後，用0. 22um的無菌濾器除 去細菌等汙染物。然後用1640培養基稀釋到2mg/ml。細胞毒性測試
將本發明四倍梯度稀釋後，各取50ml加入到在96孔板中IOOml生長良好的 CEMX 174細胞懸液中，同時加入單獨不同梯度本發明對照孔和細胞對照孔。37°C孵育24h 後，加入10%的AlarmarBlue細胞活力檢測試劑。孵育4h後，在酶標檢測儀上讀取螢光值。實驗結果見圖1。由實驗結果測定桑黃的細胞毒性IC50值為603. 567ug/ml，根據此結果，本實驗選 用的濃度遠低於細胞毒性的半有效濃度，將其對細胞生長的影響降到最低，確保試驗中細 胞生長的變化是由病毒侵染造成的，提高試驗結果的準確性。1.抗猴愛滋病毒(SIV)實驗將不同濃度本發明溶液加入等量的細胞與病毒混合液。每個梯度有3個重複。作 用4天後，出現合包體後，吹散細胞團，使之分散。計算每孔合包體數目。取這樣每個梯度 的6個平均值。實驗結果見圖2。根據實驗結果計算得到本發明的IC50為75. 0324ug/ml，表明本發明具有較好的 抗SIV能力。2.抑制皰疹病毒(HSV)實驗報告病毒測定法用HSV-Blue報告病毒與不同濃度的本發明混合後，加入細胞 中，孵育24小時檢測其誘導產生的β-gal活性。由活性的高低確定抑制病毒的能力，即活 性越低抑制病毒的能力越強。實驗結果見圖3和圖4。圖3和圖4顯示，本發明在6. 25ug/ml的濃度下，具有很高的抗HSV能力。由於不 能計算其IC50值，需要進一步降低本發明的濃度，測定其IC50值。C.第二次本發明抗HSV活性復篩同樣利用報告病毒測定法確定本發明抑制病毒的能力。濃度從6. 25ug/ml依次兩 倍稀釋後，同病毒混合加入細胞，孵育24小時，測其β -gal活性。實驗結果見圖5和圖6。由圖5和圖6可知，本發明抗HSV的IC50值為2. 54901ug/ml，其治療指數為= CC50/IC50 = 603. 567/2. 5 = 241。說明其具有很好的抗HSV的能力。3.抑制腸道病毒(EV71)實驗用不同濃度的本發明與200TCID50的EV71病毒混合後，培養3天後，出現細胞病 變。吸取上清及病變細胞，然後加入MTT後孵育3-4小時後，檢測其吸光率。實驗結果見圖7。由實驗結果可知本發明抑制EV71的IC50值為0. 87ug/ml。表明本發明具有很好 的抗EV71的能力。綜合以上試驗驗證，本發明從桑黃中提取獲得的抗病毒活性物質具有較好的抗猴 愛滋病毒(SIV)，皰疹病毒(HSV)和腸道病毒(EV71)的功效。

圖1 =AlarmarBlue測定桑黃的細胞毒性圖2 不同濃度的桑黃樣品對SIV的抑制效果
圖3 不同濃度的桑黃樣品對HSV的抑制效果圖4 不同濃度的桑黃樣品誘導細胞產生的β -gal的活性圖5 不同濃度的桑黃樣品誘導細胞產生的β -gal的活性圖6 不同濃度的桑黃樣品對HSV的抑制效果圖7 桑黃樣品抑制EV71效果
具體實施方式實施例一1.將100克桑黃子實體在20°C以下的低溫中進行脫水粉碎；2.向粉碎後的桑黃子實體中加入其體積8倍的乙酸乙酯浸提3次，每次2小時，並 使用超聲波震蕩1. 5小時。抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥，獲得3. 27克粉末A。3.向乙酸乙酯提取後的濾渣中加入該濾渣8倍體積的90% (體積濃度)乙醇浸 提3次，每次2小時，並使用超聲波震蕩1. 5小時。抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥， 獲得2. 16克粉末B。4.向乙醇提取後的濾渣中加入該濾渣15倍體積的20°C水，超聲提取4次，每次3 小時，過濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥，獲得3. 23克粉末C。5.取2克粉末A，2克粉末B和2克粉末混合均勻即可。實施例二1.將100克桑黃子實體在20°C以下的低溫中進行脫水粉碎；2.向粉碎後的桑黃子實體中加入其體積10倍的乙酸乙酯浸提2次，每次1小時， 並使用超聲波震蕩1. 5小時。抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥，獲得2. 13克粉末A。3.向乙酸乙酯提取後的濾渣中加入該濾渣10倍體積的90% (體積濃度)乙醇浸 提2次，每次1小時，並使用超聲波震蕩1. 5小時。抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥， 獲得1.27克粉末B。4.向乙醇提取後的濾渣中加入該濾渣28倍體積的20°C水，超聲提取2次，每次4 小時，過濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥，獲得3. 17克粉末C。5.取1. 8克粉末A，1. 1克粉末B和2. 5克粉末混合均勻即可。實施例三1.將100克桑黃子實體在20°C以下的低溫中進行脫水粉碎；2.向粉碎後的桑黃子實體中加入其體積3倍的乙酸乙酯浸提1次，每次1. 5小時， 並使用超聲波震蕩1. 5小時。抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥，獲得1. 15克粉末A。3.向乙酸乙酯提取後的濾渣中加入該濾渣3倍體積的90% (體積濃度)乙醇浸 提1次，每次1. 5小時，並使用超聲波震蕩1. 5小時。抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍幹 燥，獲得0. 78克粉末B。4.向乙醇提取後的濾渣中加入該濾渣9倍體積的20°C水，超聲提取1次，每次4 小時，過濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥，獲得2. 14克粉末C。 5.取1克粉末A，1. 2克粉末B和1. 8克粉末混合均勻。
權利要求
一種從桑黃中提取抗病毒活性物質的方法，由以下步驟組成(1)將桑黃子實體在低溫中進行脫水粉碎；(2)向粉碎後的桑黃子實體中加入其體積2-10倍的乙酸乙酯浸提，並使用超聲波震蕩，抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥成粉末A；(3)向乙酸乙酯提取後的濾渣中加入該濾渣2-10倍體積的90％乙醇浸提，並使用超聲波震蕩，抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥成粉末B；(4)向乙醇提取後的濾渣中加入該濾渣5-30倍體積的20℃水，超聲提取，過濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥成粉末C；(5)將粉末A，粉末B，粉末C以10％-80％∶10％-80％∶10％-80％的質量百分含量比混合均勻。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)所述的低溫為20°C以下的低溫。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(2)中所述的乙酸乙酯浸提，其浸提次數 為1-3次，每次1-2小時。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(3)中所述的乙酯浸提，其浸提次數為 1-3次，每次1-2小時。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(2)和(3)中所述的超聲波震蕩時間為 1-4小時。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(4)中所述的超聲提取，其提取次數為 1-4次，每次1-4小時。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所獲得的活性物質具有較好的抗猴愛滋病毒 (SIV)，皰疹病毒(HSV)和腸道病毒(EV71)的功效。
全文摘要
本發明所述的從桑黃中提取抗病毒活性物質的方法涉及一種從中藥中提取活性物質的方法。其包括將桑黃子實體在低溫中進行脫水粉碎；向粉碎後的子實體中加入其體積2-10倍的乙酸乙酯浸提，超聲波震蕩，抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥成粉末A。向乙酸乙酯提取後的濾渣中加入其2-10倍體積的90％乙醇浸提，超聲波震蕩，抽濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥成粉末B。向乙醇提取後的濾渣中加入其5-30倍體積的20℃水，超聲提取，過濾後合併濾液，將濾液濃縮冷凍乾燥成粉末C。將粉末A，粉末B，粉末C以10％-80％∶10％-80％∶10％-80％的質量百分含量比混合均勻。本發明所獲得的活性物質具有較好的抗猴愛滋病毒(SIV)，皰疹病毒(HSV)和腸道病毒(EV71)的功效。
文檔編號A61P31/22GK101810646SQ20101014468
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月4日 優先權日2010年4月4日
發明者餘雄濤, 張智, 李向敏, 李崇, 李森柱, 楊小兵, 潘鴻輝, 焦春偉, 蔡勉華, 謝意珍, 陳冠州 申請人:廣東粵微食用菌技術有限公司