阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應用的製作方法
2023-07-21 06:11:21
專利名稱：阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及川芎中抗癌活性成份的研發，具體地說是阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應用。
背景技術：
由於中藥是祖國醫藥學的寶貴遺產，迄今已有數千年的臨床實踐，並形成了系統的傳統中醫理論體系，在我國有著極其廣泛的應用基礎。以中藥為本開發新藥具有目標明確、毒副作用小、原料來源多等有利因素。
川芎Rhizoma Chuanxiong為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的乾燥根莖，具有行氣活血，祛風止痛之功效，為活血化瘀常用中藥。據報導其含有內酯類、生物鹼、有機酸類或酚類、以及中性油類等多種有效成分。目前報導的關於川芎有效成分的主要藥理作用有川芎嗪有增加冠脈流量，降低冠脈阻力，促進動脈微循環，對血小板凝聚有解聚作用；川芎浸膏能抑制小腸收縮和妊娠都子宮的收縮，生物鹼、阿魏酸、川芎內酯有解痙作用；水煎劑能夠抑制咖啡因的興奮作用；川芎揮髮油有鎮靜作用；川芎提取物對細菌及真菌有抑制作用；含有川芎的複方可用於輔助腫瘤治療[文獻1.閻德海.CN 1109337A，1995抗腫瘤中藥調節復元湯；文獻2.沈漢澄.CN 1092972C，2002一種抗腫瘤及抗癌轉移的藥物；文獻3.趙金華，趙耘，姚倩等.CN 1362064A，2002一種抗腫瘤組合物及其製備方法和用途；文獻4.徐修禮，張建芳，劉寶瑞等.腫瘤.22(2)，107-108，2002川芎素對大腸癌細胞moser的影響及其與化療藥物的協同作用]。
到目前為止，有關川芎有效成分能夠抑制腫瘤細胞的報導只有川芎嗪[文獻5.張春玲，肖偉，王英年.中華實用醫學.4(9)，26-29，2002黃芪、川芎嗪對腸癌患者陽PMBC分泌IL-4、IL-6的調節作用；文獻6.林洪生，李樹奇，裴迎霞等.中國新藥雜誌.8(6)，384-386，1999川芎嗪、苦參鹼對癌細胞與內皮細胞粘附及粘附因子表達的影響；文獻7.林洪生，李樹奇，樸炳奎等.中國腫瘤.8(12)，574-576，1999三參衝劑對肺癌轉移中內皮細胞及粘附因子的影響；文獻8.崔巍，徐世傑，藤靜茹等.中國中醫基礎醫學雜誌.3(1)，27-28，31，1997活血化瘀中藥抑制腫瘤細胞——血小板聚集的實驗研究]，但是川芎嗪在川芎中的含量極低，同時川芎嗪易升華，因此從川芎中提取川芎嗪用於抗腫瘤研究未見報導。
發明內容
本發明的目的在於為以中藥有效成分為基礎的新藥設計提供新的先導化合物—即研發鬆柏醇阿魏酸酯在抗癌藥物中的應用。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為
通過色譜分離技術並結合體外藥理學實驗方法，從傳統中藥——川芎中篩選出具有生理活性的有效成分—阿魏酸松柏酯。
本發明採用製備級色譜從川芎中分離純化出一種酯類化合物，並通過液相色譜與質譜聯用、氣相色譜與質譜聯用、紅外光譜、紫外光譜、核磁共振對該化合物進行了結構鑑定。在抗腫瘤的MTT實驗中發現該化合物具有抑制腫瘤細胞生長的生理活性。
具體為從傳統中藥——川芎中製備3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯，及其結構鑑定；稱量一定量的川芎粉末置入燒瓶內，加入無水乙醇加熱回流，經過濾得到提取液，揮發掉提取液中溶劑得膏狀物；在一定淋洗條件下(以乙腈/水為流動相)，以裝有C18 SPE(固相萃取)柱分離上述提取物，收集洗脫的餾分；經液質聯用分析後，將含有3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯餾分揮發掉溶劑得膏狀物。以製備型HPLCC18柱純化經初步提純的膏狀物，收集3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的峰。經減壓蒸餾揮發掉溶劑，得到純度在98％以上的純品。最終由RP-HPLC、紫外光譜、質譜、紅外光譜進行結構鑑定，分子式為C20H20O6結構式如下(也稱阿魏酸松柏酯) 本發明具有如下優點1.為以中藥有效成分為基礎的新藥設計提供新的先導化合物。本發明首次從傳統中藥——川芎中分離純化出一種酯類的化合物——3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯，也稱為阿魏酸松柏酯。
2.建立了該化合物的液相色譜分離純化方法，操作簡便易行。採用本發明中的製備方法，可以比較快捷地分離、純化出3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯，純度在98％以上。同時由於採用HPLC技術，本方法還具有重複性好，條件溫和，非常適用於化學穩定性差的中藥有效成分的製備。
3.本發明應用的化合物具有一定的抗腫瘤細胞(宮頸癌Hela細胞)的活性，且無毒副作用。由於目前的抗腫瘤藥物普遍存在著明顯的毒副作用，而該化合物來源於常用的中藥，因此更具有進行結構改造和研究的價值，為以中藥為基礎的新抗癌藥物開發及產業化打下基礎。
具體實施例方式
實施例1稱量經粉碎(35目)川芎粉末120g置入燒瓶內，加入700mL無水乙醇，浸泡30min，加熱回流1h，過濾(0.5μm)製備提取液。減壓蒸餾揮發掉提取液中溶劑得膏狀物。以裝有30g的40μm C18填料的SPE柱分離上述提取物，分別用30/70，50/50(v/v)的乙腈/水溶液和純乙腈淋洗，收集洗脫的餾分。經液質聯用分析，3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯在50％乙腈溶液洗脫的餾分中。減壓蒸餾揮發掉溶劑得膏狀物。以製備型HPLCC18柱純化上述初步提純的膏狀物，流動相為37/63(v/v)的乙腈/水溶液，收集3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的峰。經減壓蒸餾揮發掉溶劑，得到純度在98％以上的純品。對宮頸癌Hela細胞的抑制率為50％時的濃度約為3.7μg/μL。
在本發明中，也可以用其他溶劑對川芎進行提取，諸如甲醇、95％乙醇、水等，但是經過實驗乙醇在浸出3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的效率高於其他溶劑。
應用例體外MTT(四唑鹽)法測量3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯對宮頸癌Hela細胞的抑制率；取90mg阿魏酸松柏酯溶於250μL無水乙醇中，加入250μL PBS稀釋，分別加入4、6、8、10、12μL至培養宮頸癌Hela細胞的96孔板中(平行測定8孔)。培養後，利用ELISA檢測儀在570nm測定光密度；抑制率分別為47.7％、79.4％、79.4％、82.1％、83.2％。實驗結果表明3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯有一定的抗腫瘤活性。
MTT的檢測方法1以每孔103---104密度接種細胞於96孔板上。
2細胞培養結束後，每孔加入MTT(5mg/ml)，37℃孵育3-4小時，終止培養，小心吸棄上清液。每孔加入0.1-.0.2mlDMSO，振蕩10分鐘，使結晶物溶解。
3比色用酶聯免疫檢測儀在570nm處測定其吸收度。
權利要求
1.阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應用。
2.按照權利要求1所述阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應用，其特徵在於所述的阿魏酸松柏酯是從川芎中分離獲取的。
3.按照權利要求2所述阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應用，其特徵在於所述阿魏酸松柏酯的分離獲取過程如下，川芎粉末置於溶液中加熱回流，過濾得到提取液，揮發掉提取液中溶劑得膏狀物；在乙腈/水為流動相的淋洗條件下，以裝有C18 SPE柱分離上述提取物，收集洗脫的餾分；通過液相色譜與質譜聯用分析後，將含有3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯餾分揮發掉溶劑得膏狀物；以製備型HPLC C18柱純化經初步提純的膏狀物，收集3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的峰，經減壓蒸餾揮發掉溶劑，得到產品。
4.按照權利要求3所述阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應用，其特徵在於所述溶液為甲醇、95％乙醇、乙醇或水。
5.按照權利要求3所述阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應用，其特徵在於所述溶液為乙醇。
6.按照權利要求3所述阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應用，其特徵在於所述乙腈/水的體積比例為30～100∶0～70。
全文摘要
本發明涉及川芎中抗癌活性成分的研發，具體地說是阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應用。本發明的優點如下本發明首次從傳統中藥——川芎中分離純化出阿魏酸松柏酯，為以中藥有效成分為基礎的新藥設計提供新的先導化合物；建立了該化合物的液相色譜分離純化方法，操作簡便易行、重複性好，條件溫和，非常適用於化學穩定性差的中藥有效成分的製備；為以中藥為基礎的新抗癌藥物開發及產業化打下基礎。
文檔編號A61K31/216GK1608616SQ200310104929
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月24日 優先權日2003年10月24日
發明者鄒漢法, 孔亮, 孫乃昌, 吳麗華, 陳學國 申請人:中國科學院大連化學物理研究所