抗人b7-h3單克隆抗體的製備及其應用的製作方法

2023-07-21 15:58:11 1

專利名稱：：抗人b7-h3單克隆抗體的製備及其應用的製作方法抗人B7-H3單克隆抗體的製備及其應用發明的領域本發明涉及免疫球蛋白超家族成員的結合蛋白質或多肽，更具體地說，本發明涉及抗人B7-H3單克隆抗體4H7和21D4，其製備方法以及這些單克隆抗體在腫瘤(胃癌)預後評價及作為標記分子在鑑定人樹突狀細胞(DC)的中的應用。發明的背景已知有許多受體-配體相互作用都參與誘導、建立和調節抗原特異性免疫反應。為了有效地激活T細胞反應，通常至少需要兩個信號。其中除T細胞抗原受體(TCR)識別抗原提呈細胞(APC)上的MHC-抗原複合物以提供第一信號即抗原特異性信號外，還必須獲得T細胞與APC表達的共刺激分子相互作用後產生的非抗原特異性、非MHC限制性的第二信號。第二信號即為共刺激信號或協同刺激信號。如果僅有抗原特異性信號而缺失共刺激信號，T細胞將表現為無反應或免疫耐受狀態，甚至導致凋亡。可見，共刺激信號是T細胞克隆擴增、分化和發揮生物效應所必不可少的。因此可以認為，第一信號決定了T細胞活化的特異性，而第二信號則決定T細胞介導的免疫應答能否有效進行(NoelleRJ,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:6550,1992;AllenRCetal"Science.259:990,1993)。近年來，分子生物學技術廣泛應用於免疫學研究，共剌激分子被不斷發現。根據其結構，這些共刺激分子可分為兩類一類是腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體(TNF/TNFR)超家族，包括CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4-1BBL和Fas/FasL等。另一類是免疫球蛋白超家族，如B7-CD28/CTLA4、LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3、ICOS-GL50、CD2/LFA-3等(KorthauerUetal.，Nature,361:539，1993)。這些共刺激分子以受體和配體相互作用的方式傳導信號。受體和配體一般表達在不同的細胞表面，通常一個為持續性表達，一個是誘導性表達。在免疫應答的不同階段，這些分子以各自獨特而又相關聯的方式參與信號傳導，共同調控機體的免疫應答。人B7-H3(CD276)是2001年由Chapoval等人克隆的由316個胺基酸組成的I型跨膜球蛋白(包括信號肽、一對VC免疫球蛋白胞外段、跨膜區和胞漿區)。在空間結構上，該分子的配體-受體結構域與B7家族其他成員的同源性分別為27%(B7-H1)、25%(B7-H2)、21%(B7墨l)和20%(B7-2)。Northern印跡分析表明，B7-H3mRNA在人類很多組織如心臟、肝臟、前列腺、胎盤、睪丸、胰腺、小腸和大腸都有很高的表達。最初的研究發現，B7-H3能協同刺激CD4+，CD8+T細胞的增殖，增加CTL活性和提高IFN-Y分泌的表達。而且，B7-H3對IL-8,TNF-a產生也有上調作用。因此，認為B7-H3是一種正性調控分子(ChapovalAIetal.Nat.Immunol.,2001,2:269-274.)。但在隨後的研究中發現，2IgB7-H3和4IgB7-H3融合蛋白均可抑制CD4+T淋巴細胞的體外增殖，下調T細胞對IFN-y、11-10、IL-2、IL-6和IL-8等細胞因子的分泌(LingVetalGenomics,2003,82:365-377.)。Suh等人通過建立B7-H3基因敲除小鼠模型，在實驗性自身免疫性腦炎(EAE)實驗研究中發現，B7-H3基因敲除小鼠體內輔助T細胞難以分化成I型輔助T細胞，而可以向II型輔助T細胞正常分化；基因敲除小鼠體內CD4+，CD8+T細胞數量均低於野生型小鼠。因此認為，B7-H3通過下調I型輔助T細胞介導的免疫反應下調機體的免疫應答(SuhWKetal.NatImmunol.，2003,4:899-906.)。關於B7-H3分子在腫瘤免疫中所起的生物學作用的研究也剛剛起步。例如，Sun等人首先將含有小鼠B7-H3的表達載體注入EL-4淋巴瘤組織中，然後把處理後的腫瘤組織移植到小鼠體內，結果顯示，B7-H3可以有效的抑制直徑小於0.3釐米的腫瘤的生長甚至使其完全消退(>50%)，而對直徑大於0.3釐米的腫瘤則可明顯減慢其增殖的速度。進一步研究表明，B7-H3是通過調控CD8+的CTL和NK細胞來實現其體內抗腫瘤免疫應答的(SunXetal.GeneTher.,2003,10:1728-1734.)。Luo等人發現，B7-H3分子能明顯抑制腫瘤的生長速度。分析接種小鼠體內的淋巴細胞的變化，發現B7-H3主要是通過作用於CD8+T淋巴細胞來發揮其抗腫瘤的生物學作用的(LuoLetal.J.Immunol.,2004，173:5445-5450.)。但也有學者發現，B7-H3可通過某種未知的信號通路來下調NK細胞的生物學功能，從而使得表達該分子的神經母細胞瘤細胞免於被NK細胞殺傷(RobertaCetal.Proc.Natl.Acad.Sci"2004，101:12640-12645.)。最近的研究發現，表達於DCs及T細胞上的B7-H3分子能促進T淋巴細胞的體外活化增殖。在應用免疫抑制劑的前體下，阻斷B7-H3信號可顯著提高同源異體移植植物的存活時間、減弱急慢性移植物排斥反應(WangLetal.J.Immunol"2005,35:428438.)。B7-H3作為一個新近發新的共刺激分子，其生物學功能的研究剛剛起步且存在較大爭議。鑑於該家族中其他成員(如B7-1，B7-2，B7-H1，B7-H2,B7-H4等)在腫瘤的發生發展中都起了重要的作用，因此推測B7-H3在腫瘤發生發展中也具有重要作用。本發明人利用自行研製的兩株鼠抗人B7-H3單克隆抗體(4H7，21D4)，進行了大規模的臨床腫瘤標本篩選，結果發現B7-H3分子的表達與胃癌預後呈正相關關係。因此，B7-H3在腫瘤組織上的表達水平有可能作為評價腫瘤患者術後生存的一重要評價指標。DC是實體內最重要的、功能最強的APC，其最大的特點是能激發未致敏的T淋巴細胞活化。因此，DC在免疫應答中有著獨特的地位。近年來的研究表明，機體有可能通過調節DC的功能來調節免疫應答，從而對腫瘤，移植排斥和自身免疫疾病的治療與預防中發揮重要作用。然而，由於DC在組織當中數量極少而且細胞表面缺乏特徵性標記，大大限制了對DC功能的深入研究。儘管繼後建立了DC的體外擴增方法，但仍因缺乏特徵性表面標記，而使DC分離的純化和表型鑑定遇到困難。我們還發現，B7-H3分子可持續穩定地在0014+/0034+來源的樹突狀細胞上高表達，而在外周血T，B，NK,單核細胞上則不表達或表達水平很低。據此我們認為，B7-H3分子可能是一種較為特異的DC表面標記分子。有鑑於此，B7-H3單克隆抗體可望在DC表型鑑定、分離和純化上發揮重要的應用價值。發明目的本發明的一個目的是提供一組選自4H7和21D4的抗人B7-H3單克隆抗體。根據本發明的優選實施方案，如上限定的抗人B7-H3單克隆抗體4H7和21D4是抗可溶性人B7-H3的單克隆抗體。本發明的另一個目的是提供製備如上限定的抗人B7-H3單克隆抗體的方法，該方法包括(1)用預製備的高表達人B7-H3分子的轉基因細胞作為免疫原免疫動物；(2)分離被免疫動物的脾淋巴細胞並在適於產生雜交瘤細胞的條件下與適當的骨髓瘤細胞融合；(3)篩選並培養如上得到的雜交瘤細胞；(4)從細胞培養液或接種雜交瘤細胞的動物的腹水液中分離並純化所需的單克隆抗體。根據本發明的優選實施方案，其中產生抗人B7-H3單克隆抗體4H7和21D4的雜交瘤細胞株的保藏編號分別為CGMCCNo.1638和CGMCCNo.1639。本發明的再一個目的是提供如上限定的抗人B7-H3單克隆抗體4H7和21D4在胃癌預後評價中的應用。本發明的再一個目的是提供如上限定的抗人B7-H3單克隆抗體21D4和4H7作為標記分子在DC表型鑑定及篩選中的應用。附圖簡要說明圖1顯示以流式細胞術分析抗人B7-H3單克隆抗體4H7和21D4對轉基因細胞上B7-H3分子的識別。其中灰色峰為陰性對照，第一抗體(簡稱一抗)為兔IgG，第二抗體(簡稱二抗)為螢光素PE標記的羊抗兔IgG。透明峰顯示轉基因細胞與兔抗人B7-H3多抗反應的結果，其中第一抗體分別是兔抗人B7-H3多克隆抗抗體，第二抗體是螢光素PE標記的羊抗兔IgG。圖2顯示流式細胞技術分析兩株特異性抗B7-H3單抗的特異性鑑定。將生長良好的L929/B7-H3細胞或L929/mock細胞(L929細胞株源於美國典型培養物保藏中心(ATCC,CCLl))，用含2%小牛血清的PBS洗滌後分於流式管中(5xl0S個/管)。其中灰色峰為陰性對照，第一抗體(以下有時簡稱一抗)為鼠IgG，第二抗體為螢光素PE標記的羊抗鼠IgG。透明峰顯示轉基因細胞與鼠抗人B7-H3單抗(4H7或21D4)反應的結果，其中第一抗體分別是兔抗人B7-H3單克隆抗體(以下有時簡稱單抗)(4H7或21D4)，第二抗體(以下有時簡稱二抗)是螢光素PE標記的羊抗鼠IgG。圖3顯示以蛋白印跡法(Westernblot)分析兩株抗B7-H3單抗的特異性。收集生長良好的293T、L929/B7-H3和L929/mock細胞(各5xl(^個)，用預冷的PBS洗滌細胞並孵育後，依次加入細胞膜裂解液(RIPA)0.5ml和蛋白酶抑制劑(PMSF)100^d，分別抽提3種細胞的膜蛋白。對三種蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳並電轉移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉後，4r過夜。次日，用PBS誦T洗滌並加入稀釋的抗體4H7(1:1000稀釋)或21D4(1:1000稀釋)，封閉1小時。然後，用PBS-T充分洗滌並加入鹼性磷酸酶(AP)標記的兔抗鼠IgG二抗，室溫孵育2小時。再次洗細胞並用NBT/BCIP顯色系統顯色。圖4顯示以流式細胞術分析單抗4H7和21D4識別的抗原位點的競爭性抑制。L929/B7-H3細胞(5xl0V管)用PBS洗滌後，依次加入單克隆抗體(每管2g)、生物素標記的單抗、鏈黴菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，並洗滌和溫育後用流式細胞儀分析，同時設陽性和陰性對照組。1:抗體21D4競爭結合抗體4H7所識別的B7-H3位點。透明峰為陰性對照，其中一抗為生物素標記的小鼠IgG，二抗為Streptavidin-PE。灰色峰和黑色峰顯示4H7與21D4對位點的競爭性。將4H7加入L929/B7-H3反應後，再與生物素標記的4H7(灰色峰)或21D4(黑色峰)作用，最後加入藻紅蛋白標記的鏈親和素(Streptavidin-PE)，流式細胞儀進行檢測2:同方法l，觀察抗體4H7競爭結合抗體21D4所識別的B7-H3位點。圖5顯示以流式細胞術分析4H7、和21d4對外周血淋巴細胞上的B7-H3分子的識別。常規分離健康人外周血單個核細胞(PBMCs)，將B7-H3單抗(21D4)或同型對照鼠IgGl與新鮮分離的PBMCs或經過處理活化後的PBMCs4'C反應30分鐘，離心洗淨未結合到細胞膜上的抗體後加入FITC標記的羊抗鼠二抗，4。C避光反應30分鐘。然後將細胞分成數管，分別與PE標記的抗CD3、CD14和CD19單克隆抗體4。C避光反應30分鐘。離心洗滌後，以流式細胞技術檢測B7-H3在外周血淋巴細胞上的表達。其中灰色峰為陰性對照，一抗為鼠IgG,二抗為螢光素PE標記的羊抗鼠IgG。透明峰顯示轉基因細胞與鼠抗人B7-H3單抗(4H7或21D4)反應結果,其中第一抗體分別是兔抗人B7-H3單抗21D4，第二抗體是螢光素PE標記的羊抗鼠IgG。圖6顯示以流式細胞術分析單抗21D4對Mo-DCs上B7-H3分子的識別能力。參照文獻分離健康人外周血單個核細胞(PBMC)(金伯泉，第四軍醫大學出版社,2002)，洗細胞後，將細胞(3xl06/ml)加入6孔培養板(2ml/孔)中，37°C培養2小時。培養後除去細胞在培養板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)、10%FCS、0.02mmol/LL-穀氨醯胺、二巰基乙醇(2-ME，5xl0-5mol/L)的RPMI-1640繼續培養(每3天換液一次)。培養7天後，加入5C11(5ng/ml)或TNF-a(10ng/ml)誘導3天。然後，收集各誘導組處於不同發育階段的DCs,通過流式細胞儀分析細胞表面B7-H3的表達。(a，)單抗21D4對未成熟Mo-DCs表面分子B7-H3的識別能力。其中灰色峰為陰性對照，一抗為鼠IgG，二抗為螢光素PE標記的羊抗鼠IgG。透明峰顯示轉基因細胞與鼠抗人B7-H3單抗(4H7或21D4)反應的結果，其中第一抗體分別是兔抗人B7-H3單抗21D4，第二抗體是螢光素PE標記的羊抗鼠IgG。單抗4H7也有類似的識別能力(圖略)。(b,)單抗21D4對成熟Mo-DCs表面分子B7-H3的識別能力。其中灰色峰為陰性對照，一抗為鼠IgG，二抗為螢光素PE標記的羊抗鼠IgG。透明峰顯示轉基因細胞與鼠抗人B7-H3單抗(4H7或21D4)反應的結果，其中第一抗體分別是兔抗人B7-H3單抗21D4，第二抗體是螢光素PE標記的羊抗鼠IgG。圖7顯示以Westernblot免疫印跡法分析單抗21D4及4H7對Mo-DCs的識別。收集生長狀態良好的Mo-DCs(約5>0.05)。與患者術後生存時間的關係分析表明，B7-H3的表達與胃癌患者預後有關，生存期大於5年的胃癌患者B7-H3的表達陽性率(74.5%)顯著高於生存期小於2年的胃癌患者(43.1%)(x2=10.36，P0.05);而與浸潤深度、生存期、組織學類型有關。在胃癌組織類型為分化型(X^4.55，P<0.05)、腫瘤浸潤未達深肌層(？=5.56，P<0.05)B7-H3表達陽性率較高。7)胃癌生存期相關因素的多變量分析將浸潤深度、生存期、組織類型、B7-H3的表達等納入相關因素變量分析表明，單變量分析提示，腫瘤浸潤深度、生存期和組織類型與B7-H3的表達有關。多變量分析顯示，.B7-H3的表達對胃癌生存期的相對危險度為2.803，95%可信區間為1.051-7.477，P值為0.040。可見，B7-H3的表達與腫瘤浸潤深度、組織類型相關。因此可以認為，B7-H3的表達是影響胃癌生存期的獨立因素，具有重要的臨床意義。有關實驗數據詳見下列表l。B7-H3表達與胃癌臨床病理的關係(陽性率％)tableseeoriginaldocumentpage16由以上表l所示的結果可以看出，B7-H3的表達與患者的年齡、性別無關(p>0.05)，而且與腫瘤腫瘤發生部位和大小，以及有無淋巴結轉移無關(P>0.05)。相反，B7-H3的表達水平與腫瘤浸潤深度、生存期及組織學類型有關。特別是，胃癌組織類型為分化型(^=4.55，P<0.05)、腫瘤浸潤未達深肌層(X2=5.56，PO.05)的細胞的B7-H3表達陽性率明顯升高。因此，可以使用本發明的單克隆抗體製備用於胃癌預後評價，或鑑定人樹突狀細胞(DC)的試劑盒。所說的試劑盒除包括本發明的抗細胞表面B7-H3分子的單克隆抗體外，還可包括血液樣品收集裝置以及相關溶劑、緩衝液和標準品等。雜交瘤樣品保藏鑑於陽性雜交瘤特別是以高產率產生本發明單克隆抗體的雜交瘤篩選的偶然機遇性，也是作為對本說明書文字描述部分的補充，本申請人在微生物保藏機構中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)保藏了分別產生本發明的單克隆抗體4H7和21D4的兩個雜交瘤細胞株，它們的保藏編號分別為CGMCCNo.1638和CGMCCNo.1639。權利要求1、抗人B7-H3單克隆抗體4H7和21D4。2、根據權利要求l的抗人B7-H3單克隆抗體，特徵在於這些抗體是抗可溶性人B7-H3的單克隆抗體。3、根據權利要求1的單克隆抗體，其中抗人B7-H3單克隆抗體4H7是由保藏編號為CGMCCNo.1638的雜交瘤細胞系分泌的。4、根據權利要求1的單克隆抗體，其中抗人B7-H3單克隆抗體21D4是由保藏編號為CGMCCNo.1639的雜交瘤細胞系分泌的。5、根據權利要求1的抗人B7-H3單克隆抗體4H7和21D4在腫瘤預後評價中的應用。6根據權利要求1的抗人B7-H3單克隆抗體4H7和21D4作為標記性分子在鑑定樹突狀細胞中的應用。全文摘要本發明涉及免疫球蛋白超家族成員的結合蛋白質或多肽，更具體地說，本發明涉及抗人B7-H3單克隆抗體4H7和21D4，其製備方法以及這些單克隆抗體在腫瘤(胃癌)預後評價及作為鑑定人樹突狀細胞(DC)的標記分子中的應用。文檔編號G01N33/577GK101104639SQ20061008830公開日2008年1月16日申請日期2006年7月10日優先權日2006年7月10日發明者張光波,張學光申請人:蘇州大學