添加十六烷基三甲基溴化銨提高穀氨醯胺轉胺酶產量的方法
2023-07-21 02:14:21 1
專利名稱：添加十六烷基三甲基溴化銨提高穀氨醯胺轉胺酶產量的方法
技術領域：
添加十六烷基三甲基溴化銨提高穀氨醯胺轉胺酶產量的方法，涉及吸水鏈黴菌發酵製備穀氨醯胺轉胺酶技術領域。
背景技術：
穀氨醯胺轉胺酶(Microbial transglutaminase，簡稱MTG)是一種催化醯基轉移反應的轉移酶，能催化蛋白質分子內、分子間發生交聯，蛋白質和胺基酸之間的連接以及蛋白質分子內穀氨醯胺基的水解反應，從而直接改變蛋白質本身以及蛋白質所附著的細胞、組織等的結構與功能性質的特性，提高蛋白質的營養價值，生產出滿足人們需求的新型蛋白食品。現在穀氨醯胺轉胺酶已經廣泛應用在許多方面在食品加工過程中，可以保護食品蛋白質中的賴氨酸避免發生化學反應，從而保護限制性胺基酸，提高食品的營養價值；在肉製品加工中，穀氨醯胺轉胺酶的交聯作用將一些低價值的碎肉進行重組，從而改善其外觀、結構、風味，以提高其營養價值和市場價值；在水產品保鮮中，可通過形成可食性的薄膜，包埋脂類物質；在乳製品加工中，提高蛋白質的營養性；在醫藥工業中，穀氨醯胺轉胺酶包埋脂類或脂溶性物質，形成耐熱耐水性的膜；在非肉類的豆類食品中，提高食品的彈性和持水能力；在紡織行業，還被用來提高蠶絲織物以及羊毛織物的品質。
現在生產穀氨醯胺轉胺酶的方法主要是微生物發酵法生產，目前商業化的產品主要由日本味之素等公司生產。國內用微生物生產尚處於研究階段，菌種主要為茂原鏈黴菌，生產水平較低。
發明內容
本發明的目的是提供一種添加十六烷基三甲基溴化銨提高發酵法製備穀氨醯胺轉胺酶產量的方法。
本發明的技術方案菌種吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，CCTCC NO203062(中國專利03152956.9，2003年.)，由江南大學生物工程學院環境生物技術研究室保藏和提供。
培養基麥汁斜面培養基(g/L)麥汁50，葡萄糖4，酵母膏4，瓊脂20，pH7.0，種子培養基(g/L)甘油20，葡萄糖20，酵母膏5，NaH2PO45，Na2HPO45，MgSO45，pH7.0。
發酵培養基(g/L)澱粉5，甘油20，葡萄糖5，蛋白腖15，冷榨豆餅粉30，酵母膏5，碳酸鈣5，NaH2PO45，Na2HPO45，MgSO45，pH8.0。
培養方法將成熟的孢子接種到麥汁斜面上，32℃下培養10～20d。待孢子成熟後，刮取斜面上的孢子，用無菌水製成孢子懸液接種於種子培養基中，32℃搖床培養至對數生長後期。吸取種子培養液，按4％～8％的接種量接種於發酵培養基中，32℃搖床培養48h。
穀氨醯胺轉胺酶活力的測定方法發酵液經離心後的清液稀釋5倍後用於活力的測定。穀氨醯胺轉胺酶活力採用分光光度法在37℃下測定。吸取0.4ml稀釋樣品於試管中，加入1ml試劑A；37℃水浴保溫10min，加入0.4ml試劑B，終止反應，525nm波長比色。試劑A將100mg底物CBZ-GLN-GLY(Nalpha-Carbobenzyloxy-GlutamineGlycine)完全溶解幹2ml 0.2N的NaOH溶液中，並加入4ml a溶液，2ml b溶液和2ml c溶液，調pH為6.0。[a溶液0.2M三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩衝液，pH6.0；b溶液1M羥胺；c溶液0.01M GSH(還原型谷光甘肽)]。試劑B3N HCl，12％TCA(三氯乙酸)，5％FeCl3·6H2O(溶於0.1NHCl中)按1∶1∶1混合配製。一個單位穀氨醯胺轉胺酶酶活定義(u/mL)；37℃時每分鐘催化形成1μmol的L-穀氨酸-γ-單羥胺酸的酶量。
提高穀氨醯胺轉胺酶產量的培養方式穀氨醯胺轉胺酶是一種胞外酶，首先生成沒有酶活力的酶原，經蛋白酶切割後生成有活力的成熟酶。在普通的發酵過程中，由於蛋白酶抑制劑的存在，酶原只能在特定階段緩慢逐步地轉化為成熟酶。十六烷基三甲基溴化銨可以與活化蛋白酶抑制劑結合使其無法抑制蛋白酶。
在發酵過程中，適時添加適量的十六烷基三甲基溴化銨可以促進產酶，可以使酶原大量迅速地轉化為成熟酶，提高穀氨醯胺轉胺酶的發酵產酶量。在發酵至18-26h在發酵液中添加2-20g/L的十六烷基三甲基溴化銨，實現了穀氨醯胺轉胺酶的高表達。發酵終了時發酵液中穀氨醯胺轉胺酶的酶活水平為5.0-5.2U/mL。
本發明的有益效果
本發明選用的吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13合成的穀氨醯胺轉胺酶為胞外酶，並且是迄今為止已報導過的熱、鹼穩定性和蛋白質交聯特性都較好的穀氨醯胺轉胺酶，用於食品加工、醫藥行業以及紡織行業具有很大的潛力。所用的十六烷基三甲基溴化銨價格低廉，用量少，顯著提高了穀氨醯胺轉胺酶的產量，搖瓶培養的實驗水平達國內領先水平。
具體實施例方式
實施例1在穀氨醯胺轉胺酶發酵液中，在發酵的18h添加10g/L的十六烷基三甲基溴化銨，發酵結束時，發酵液中的穀氨醯胺轉胺酶產量為5.20U/mL，比不加十六烷基三甲基溴化銨的對照例提高了24.7％。不添加十六烷基三甲基溴化銨的發酵液中的穀氨醯胺轉胺酶產量為4.17U/mL。
實施例2在穀氨醯胺轉胺酶發酵液中，在發酵的22h添加20g/L的十六烷基三甲基溴化銨，發酵結束時，發酵液中的穀氨醯胺轉胺酶產量為5.12U/mL。
實施例3在穀氨醯胺轉胺酶發酵液中，在發酵的26h添加2g/L的十六烷基三甲基溴化銨，發酵結束時，發酵液中的穀氨醯胺轉胺酶產量為5.02u/mL。
權利要求
1.一種提高發酵法製備穀氨醯胺轉胺酶產量的方法，其特徵是採用吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，菌種保藏編號為CCTCC NO203062，作為出發菌株，經液體發酵製備穀氨醯胺轉胺酶，通過在發酵過程中添加十六烷基三甲基溴化銨，提高穀氨醯胺轉胺酶的發酵產酶量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是在發酵過程中添加十六烷基三甲基溴化銨，發酵至18-26h在發酵液中添加2-20g/L的十六烷基三甲基溴化銨。
全文摘要
添加十六烷基三甲基溴化銨提高穀氨醯胺轉胺酶產量的方法，涉及吸水鏈黴菌發酵製備穀氨醯胺轉胺酶技術領域。本發明採用吸水鏈黴菌為發酵菌株，經斜面培養和種子培養後，接種在發酵培養基中經液體發酵製備穀氨醯胺轉胺酶。通過在發酵過程中添加十六烷基三甲基溴化銨，實現了提高穀氨醯胺轉胺酶產量的目標。本發明的優點是所用十六烷基三甲基溴化銨用量較少，且價格低廉，可顯著提高穀氨醯胺轉胺酶的產量，在其它培養條件相同的情況下，本發明比不添加十六烷基三甲基溴化銨的對照例提高產量達24.7％，達到發酵法製備穀氨醯胺轉胺酶的先進水平。
文檔編號C12R1/55GK1944633SQ20061009716
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月28日 優先權日2006年10月28日
發明者陳堅, 堵國成, 張東旭, 程力 申請人:江南大學