一種抗流感免疫多糖製劑含片及其製備辦法的製作方法
2023-07-21 08:39:36 1
一種新的中藥免疫活性成分---中華獼猴桃多糖（Actinidia Chinensis Polysaccharide,簡稱ACPS），經本發明人研究表明，作為一種新的多糖免疫調節劑，能有效抑制流感病毒的複製及預防流行性感冒。據此而創製的「抗流感免疫多糖含片」，為防治流行性感冒提供了一種新的安全有效的天然製劑。本發明屬醫藥生物學技術領域。
背景技術：
流行性感冒（簡稱流感），是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。因病毒表面抗原（HA、NA）容易發生變異，使疫苗預防流感增加變數，也使人群缺乏免疫力。所以傳播迅速，流行廣泛。過去大流行時曾奪走了數千萬人的生命。流感病毒有甲、乙、丙等型。我國曾發生十幾次較大流行。主要由甲型病毒引起。新型禽流感病毒H7N9亦屬甲型流感病毒亞型。目前尚缺特效防治流感的藥物。雖已研製出一些新藥，如金剛烷胺、三氮唑核苷、帕拉米韋等，但因這些合成的藥物，均有不同程度的毒副反應。因而從植物藥中尋找安全有效的抗流感病毒藥物，已得到了歐美等各國及我國的重視。免疫力低下者以及老年人，是流感易感人群。因此，尋找能提高免疫力的藥劑的研究工作也已展開。一種由美國推出的草藥紫錐菊製劑，用作調節免疫力、預防流感的保健食品，近年已進入我國市場。但美國FDA已發出警告稱「我們對以前批准的紫錐菊用於食品的依據不能確定。」，並責令違規公司予以糾正。不管怎樣，尋找新的既能提高機體免疫力、達到預防流感，又能直接抑制流感病毒而達到治療的天然藥物，就顯得迫切需要。
技術實現要素：
ACPS有抗流感病毒和預防流感作用。1983~1992年間，我們在最初發現民間抗癌中草藥藤梨根的提取物，具有Lectin樣作用。又歷經多年研究後，發現其活性部位是一種多糖，是由半乳糖（G）與阿拉伯糖（A）聚合而成，G/A=3.05±0.28。隨後，我們將其命名為中華獼猴桃多糖（ACPS）。並在國內外首先證明這是一種新的免疫調節劑。
進一步研究發現ACPS有明確的抗流感作用。簡述於下：
1.ACPS對病毒空斑形成的抑制作用
流感病毒感染的狗腎傳代細胞MDCK培養於凹孔板內，加入不同濃度的ACPS，對照組不加ACPS。繼續培養後，觀察計算每孔內空斑數，按公式計算：空斑抑制率%=（對照組平均空斑數-給藥組平均空斑數）/對照組平均空斑數×100%。結果如表1所示：
表1 ACPS對流感病毒空斑形成的抑制作用
結果顯示對所列流感病毒各毒株的抑制率，隨著ACPS濃度的增加而增強。濃度大於0.5mg/ml即顯示有抑制作用。ACPS對流感病毒空斑形成的抑制，表明它能抑制流感病毒的複製；
2.預先給予ACPS，對小鼠感染流感病毒的預防效果
昆明種小鼠預先腹腔一次性給藥ACPS，對照組腹腔給予生理鹽水安慰劑。24小時後，小鼠靜脈注射感染流感病毒甲型H3N2京防75-39株的尿囊液。觀察七天內小鼠死亡率，與安慰劑組比較，結果見說明書附圖圖1所示。顯示預先一次性腹腔給予ACPS，小鼠死亡率從病毒對照組(不給藥)的90％降至給藥組的30％(25mg/kg組)P＜0.01。並顯示藥效的劑量依賴關係。表明ACPS有明顯的預防流感的效果。 於感染流感病毒前24小時，一次性給予ACPS對流感小鼠的保護效果。每組小鼠10隻，腹腔注射（i.p）給藥。另外，根據總計240隻小鼠分四批次實驗，於24小時前一次性腹腔注射（i.p）給予ACPS，然後感染流感病毒。測得ACPS對流感病毒致死保護作用的半數有效劑（ED50mg/kg）分別為13.70/8.17/11.67和8.48，平均ED50為9.95±3.36；
3.不同時間預先給藥，對於小鼠流感病毒感染的預防效果
各組小鼠於靜脈感染流感病毒前24小時和6小時，分別一次性i.P給予ACPS 3.125mg/kg、6.25 mg/kg、12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg及安慰劑生理鹽水。給藥後同批靜脈注射流感病毒，觀察死亡、延長生命等情況。結果如表2所示。顯示感染前24小時給藥的預防效果優於6小時前給藥，並顯示ED50前者為6.25 mg/kg，後者為8.43 mg/kg；
表2 不同時間預先給予ACPS對小鼠靜脈感染流感病毒的保護作用
註：-6、-24即感染前6小時、24小時一次性給藥（i.P）。*P<0.05 **P<0.01
此外，於另一組實驗中，於24小時前一次性口服25 mg/kg ACPS後，感染流感病毒，顯示小鼠的保護率與生命延長率，與腹腔給藥3.125 mg/kg組相當，前者分別為22.22%和42.8%，後者分別為22.22%和47.6%；
4.ACPS誘導小鼠體內產生幹擾素
昆明種小鼠一次性i.P給予ACPS，於2、4、6、18小時取血，分離血清，2倍稀釋後，加入L929細胞培養物內，測定血清幹擾素滴度，並與陽性抗病毒藥聚肌胞Poly I:C對比，結果顯示，腹腔注射ACPS後2小時的血清幹擾素達高峰。當ACPS劑量為50mg/kg、25 mg/kg和12.5mg/kg，分別測得幹擾素滴度為160,40和10，呈量效關係。2小時的血清幹擾素滴度與Poly I:C相當，4小時後滴度下降，6小時後消失。ACPS誘生的幹擾素，對酸和熱的耐受性與聚肌胞相似。因此，可能也是α-幹擾素。如表3所示：
表3 ACPS誘生的幹擾素及其對耐酸耐熱性的比較
小結：①在體外通過病毒空斑形成抑制試驗證明ACPS能直接抑制流感病毒的複製；②在體內通過預先給藥後感染流感病毒的試驗，證明ACPS有預防流感的作用。ACPS的抗流感作用可能還與它能誘生幹擾素有關。
發現和證明ACPS的免疫調節作用：
1.體內試驗表明ACPS能增強巨噬細胞的吞噬功能及小鼠抗感染免疫力。BALB/C小鼠每日i.P 注射ACPS 32 mg/kg×12，停藥後次日測得腹腔巨噬細胞吞噬紅酵母菌的功能明顯增加，吞噬細胞的百分比從未給藥對照組的15.0±4.8，增加至給藥組的37.5±9.0(p<0.01)；吞噬指數從對照組的0.28±0.13增至給藥組的0.92±0.67（p<0.05）。另外，小鼠用半數致死量的活菌E.Coli感染後，其死亡率從對照組的50%降至給藥組的0%（p<0.0.1），但ACPS在體外並不抑制細菌生長；
2.對小鼠及人的T淋巴細胞的增殖作用
小鼠胸腺T細胞與ACPS一起培養後，加入3H-TdR後，顯示ACPS促進胸腺T細胞的DNA合成。平均CPM±SD從空白對照組的3449±231，增至給藥組的13342±2473(p<0.01)。另外，經分離獲得的人外周血T及B淋巴細胞，與ACPS一起培養，用MTT法測得T細胞的增殖代謝明顯增加，且有藥物量效關係。但B細胞無影響。如表4所示：
表4 ACPS對人T、B細胞增殖的影響
5例慢性B肝患者志願應用ACPS 2-4mg/日×10天，取外周血淋巴細胞，用單克隆抗體間接免疫螢光法測得T4及T8細胞。結果顯示T4細胞（CD4細胞）從治療前的22-30.4%（平均25.2%）增至治療後的31-37.5%（平均36.5%），T4/T8比值亦見恢復增加；
3.誘生小鼠內源性白介數2（1L-2）
小鼠每日I.P ACPS 6 mg/kg×4天，停藥後第3、6天，用1L-2依賴的T細胞株CTLL細胞，加3H-TαR摻入後，測得小鼠的脾淋巴細胞培養上清液內，其促進CTLL細胞的1L-2活性，與生理鹽水對照組比較，分別提高243%（3天，p<0.01）與265%（6天，P800mg/kg，腹腔注射，無死亡小鼠；
2.大鼠、家狗全身給藥長期毒性試驗。劑量從5 mg/kg/日-100 mg/kg/日，連續60天和180天，未見動物死亡。體重、食慾、行為無明顯變化，血、尿常規、肝腎功能均未見異常。對心、肺、肝、腎、腸等臟器病理切片檢查，未見病理性損傷；
3.家兔長期滴眼（45天），角膜刺激反應0，眼壓和瞳孔無異常，角膜病理切片檢查未見損傷。家兔靜脈注射ACPS劑量4.5 mg/kg、13.5 mg/kg、22.5 mg/kg，共計12次實驗，未測得心電圖異常，血壓呼吸亦無明顯影響。
ACPS的提取製備方法：
1.取潔淨的乾燥獼猴桃根飲片或乾果皮，粗粉碎後，加六倍沸水，室溫下浸漬過夜
2.收集浸出液；藥材再加沸水浸漬一次，收集和合併兩次浸出液
3.浸出液過濾，濾液減壓濃縮至1/10
4.濃縮液在攪拌下，緩緩加入乙醇，使終濃度達30%，靜置24小時
5.吸取上清液，同法加入乙醇達75%濃度，靜置過夜
6.離心或濾取沉澱物。加五倍量去離子水，煮沸後趁熱濾除不溶物。冷卻後緩緩加入乙醇達80%濃度，取沉澱物
7.沉澱物用無水乙醇洗滌一次，再用乙醚洗滌一次
8.沉澱物在室溫下減壓乾燥，得ACPS粗多糖乾燥無定形粉末。密封乾燥保存。
抗流感免疫多糖含片的配方組分及其製備方法：
1.配方組分：ACPS乾粉50-85%，黃金茶提取物15-45%，輔料：填充劑、潤滑劑等適量，調味劑桉葉油適量
2.製造方法：將配方藥物乾粉混勻，加適量填充劑（澱粉、糊精、糖粉及已吸附桉葉油的硫酸鈣）和潤滑溼劑（50%乙醇），迅速攪拌混勻，制軟材，機制顆粒，60℃減壓乾燥（含水量3~5%），整粒（過篩），加崩介劑混勻，壓片（0.65g/片），包衣，質量檢驗，最後包裝
備註：也可採用粉末直接壓片法（見實施例）。自製黃金茶提取物的簡要方法：取黃金茶，粗粉碎，水煎劑，濃縮後，加酸，PH=1~2，放置24小時，過濾，得析出物，製成乾粉即為黃金茶提取物。
實施例：試製10000片抗流感免疫多糖含片
處方：ACPS 2~5.5KG
黃金茶提取物 0.8~2KG
輔料：糖粉、桉葉油、微晶纖維素、硬脂酸鎂等
製法：採用粉末直接壓片法。按處方取藥粉，過60~80目篩，加入輔料混勻，幹壓成10000片。規格：每片重0.65克。用法與用量：含服，一次2片，一日10~20片，分次含服。本含片主要用於：流感的預防性含服及單純型流感的治療。
附圖說明
圖1是ACPS對小鼠感染流感病毒預防效果圖。