一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶及分離純化方法
2023-07-21 05:45:21
一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶及分離純化方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶及分離純化方法，屬於生物基因工程【技術領域】。該糖基轉移酶具有如SEQ.ID.NO.1所示的胺基酸序列。本發明一方面利用生物工程技術，在大腸桿菌BL21(DE3)中異源表達蘋果根皮苷糖基轉移酶，用於催化生成根皮苷；另一方面採用飽和硫酸銨沉澱、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephadex-75凝膠過濾色譜等分離純化方法，具有簡單易行，周期短，重複性高，酶蛋白活力高等優點。
【專利說明】一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶及分離純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物基因工程【技術領域】，具體涉及一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶及 其分離純化方法。
【背景技術】
[0002] 根皮苷（Phloridzin)屬於二氫查爾酮類，是根皮素（Phloretin)的葡萄糖苷，主 要存在於蘋果樹的根皮、莖、嫩葉以及蘋果果實中，是蘋果多酚中最具代表性的一種多酚類 成分，近年來又在多穗柯甜茶中發現了根皮苷的存在。根皮苷除了具有抗菌、抗氧化、清除 體內自由基及保護心臟等生物活性外，最突出的作用就是可以降低血糖。根皮苷專一地、競 爭性地抑制鈉離子關聯葡萄糖載體（Sodium-linked glucose transporters, SGLTs)對葡 萄糖分子的運輸，從而抑制葡萄糖在小腸和腎的吸收。因此，根皮苷可以作為一種潛在的降 糖藥物，應用前景廣闊。
[0003] 糖基轉移酶（glycosyltransferase, GT, EC2. 4. X. y)是專門催化糖基化反應的 酶類，它們將活性糖基從糖基供體轉移到糖基受體，形成糖苷鍵，產物包括寡糖、多糖、各 種複合糖（糖蛋白、糖脂）和糖苷化合物（如花色苷、黃酮糖苷、白藜蘆醇糖苷等）。在 CAZy(Carbohydrate Active enzymes Database)資料庫中，目前已劃分 94 個家族。植物 糖基化的作用是通過增加親水性改變苷元的溶解性，提供進入膜轉運系統的途徑。糖基化 通過調節重要細胞代謝物的水平、活性和定位的功能在保持細胞內平衡方面起到很大的作 用。某些糖基化反應參與植物體內激素的平衡調節。另外糖基化還能降低或除去內源和外 源物質的毒性。糖基轉移酶具有底物特異性，故植物中含有多種糖基轉移酶，如人參皂苷 肋 2葡萄糖基轉移酶、葛根素糖基轉移酶、紅景天苷糖基轉移酶、查爾酮糖基轉移酶、花青素 糖基轉移酶、染料木素糖基轉移酶、槲皮素糖基轉移酶、甜葉菊苷糖基轉移酶等。蘋果根皮 苷糖基轉移酶存在於蘋果樹的根皮、莖、嫩葉以及蘋果果實中，催化根皮素生成根皮苷。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在於提供一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶及分離純化方法，該方法 利用生物工程技術，在感受態細胞中異源表達蘋果根皮苷糖基轉移酶，經色譜分離純化，制 得重組蘋果根皮苷糖基轉移酶，方法簡單易行、周期短、重複性高。
[0005] 本發明是通過以下技術方案來實現：
[0006] 一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶，該糖基轉移酶具有如SEQ. ID. NO. 1所示的氨基 酸序列。
[0007] -種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶，編碼所述重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的核苷酸 序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
[0008] 一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的分離純化方法，包括以下步驟：
[0009] 1)採用CTAB法提取蘋果葉總RNA，以反轉錄得到的CDNA為模板，用一對帶有酶切 位點的引物FOl和ROl進行PCR擴增，經檢測後獲取目的基因條帶，對PCR產物進行回收；
[0010] 2)將步驟1)得到的PCR產物連接到pMD18-T載體上，採用熱激法轉化感受態細胞 後，篩選重組子，得到重組質粒；
[0011] 3)對重組質粒雙酶切鑑定陽性克隆、測序，得到重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的基 因序列；
[0012] 4)對含有重組質粒的菌體進行異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導表達，異源表達 產物通過飽和硫酸按沉澱、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephadex-75凝膠過濾色譜 純化，再經腸激酶切除載體標籤蛋白，獲得純化後的重組根皮苷糖基轉移酶。
[0013] 步驟1)所述的引物FOl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，引物ROl的核苷酸序 列如SEQ. ID. NO. 4所示；酶切所用的酶為BamH I和Hind III。
[0014] 所述的感受態細胞為大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞。
[0015] 所述熱激法轉化感受態細胞的具體操作為：
[0016] ①將重組質粒轉移至裝有感受態細胞的離心管中，輕輕混勻；
[0017] ②冰浴30min後，在42°C熱激90s，冰浴3min ;
[0018] ③加入無抗生素的LB液體培養基，在37 °C下振蕩培養Ih?3h ;
[0019] ④復甦後的菌液離心，吸取上清液，對留在離心管底部的菌液用移液槍吹打重 懸；
[0020] ⑤用移液槍將重懸菌液移入帶有Amp抗生素且在37°C保溫的LB固體培養基平板 上，用滅菌的塗布器塗布均勻；
[0021] ⑥將平板倒置於37°C恆溫箱中培養12?16h。
[0022] 所述對含有重組質粒的菌體進行異丙基-D-硫代半乳糖苷誘導表達具體操作 為：
[0023] 挑取含有重組質粒的單菌落接種於帶有Amp抗生素的液體LB培養基中，在37°C， 200prm下振蕩培養過夜，再按1 %的體積比接種到帶有Amp抗生素的新鮮LB培養基中， 在37°C，180rpm下，振蕩培養至0D600達0. 6?I. 0 ;加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷， 在20°C下誘導4h ;經離心收集菌體，菌體用生理鹽水洗滌，再加入細胞緩衝液，進行超聲破 碎，然後在4°C，12000rpm下離心lOmin，得到粗酶液I。
[0024] 所述飽和硫酸銨沉澱具體操作為：
[0025] 冰浴下，向粗酶液I中加入（NH4)2SO4粉末至（NH 4)2SO4終質量濃度為30%，攪拌均 勻後離心，取上清液，繼續加入（NH 4)2SO4粉末至（NH4)2SO 4終質量濃度為70%，攪拌均勻後， 4°C靜置lh，然後離心取沉澱；將沉澱用緩衝液溶解後用30kDa超濾離心管進行酶液的濃縮 和脫鹽，得到粗酶液II。
[0026] 所述DEAE-Sepharose陰離子交換層析的具體操作為：
[0027] 將粗酶液II過0. 22 μ m的濾膜，然後採用AKTA蛋白純化系統，用NaCl以lmL/min 進行線性洗脫，檢測各個洗脫峰的糖基轉移酶酶活，將有酶活的部分進行合併收集，轉入透 析袋，用PEG20000在4°C進行濃縮，得到酶液III。
[0028] 所述Sephadex-75凝膠過濾色譜純化具體操作為：
[0029] 將酶液III注射到AKTA蛋白純化系統，使用Sephadex-75凝膠柱進行純化，用緩衝 液以lmL/min流速進行洗脫，檢測各個洗脫峰的糖基轉移酶酶活，合併收集有酶活的部分， 轉入透析袋用PEG20000在4°C進行濃縮。
[0030] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0031] 本發明公開了克隆得到的蘋果根皮苷糖基轉移酶基因序列全長1452個鹼基對， 該基因編碼483個胺基酸。
[0032] 本發明一方面利用生物工程技術，在大腸桿菌BL21(DE3)中異源表達蘋果 根皮苷糖基轉移酶，用於催化生成根皮苷；另一方面採用飽和硫酸銨沉澱、陰離子 DEAE-Sepharose交換層析和Sephadex-75凝膠過濾色譜等分離純化方法，具有簡單易行， 周期短，重複性高，酶蛋白活力高等優點。
[0033] 經本發明方法分離純化得到的重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的活性最適pH值為 8. 5,活性最適溫度為45°C，當金屬離子在反應體系的終濃度為5mM時，Ca2+和Mg 2+對該重 組蘋果根皮苷糖基轉移酶有促進作用，Na+和K +作用不明顯，Al 3+、Cu2+、Mn2+和Zn 2+有顯著 的抑制作用，Cu2+的抑制作用最強。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034] 圖1為採用DEAE-S印harose FF純化重組糖基轉移酶活性峰色譜圖；
[0035] 圖2為採用Superdex? 75凝膠色譜純化重組糖基轉移酶色譜圖；
[0036] 圖3為純化後的重組蘋果根皮苷糖基轉移酶SDS-PAGE電泳圖；
[0037] 圖4為酶反應產物色譜圖；
[0038] 圖5為根皮苷標品質譜圖；
[0039] 圖6為酶反應產物質譜圖；
[0040] 圖7為pH對重組糖基轉移酶酶活的影響結果圖；
[0041] 圖8為溫度對重組糖基轉移酶酶活的影響結果圖；
[0042] 圖9為金屬離子對重組糖基轉移酶酶活的影響結果圖。
【具體實施方式】
[0043] 下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而 不是限定。
[0044] 本發明所提供的蘋果根皮苷糖基轉移酶基因克隆技術方案是：採用CTAB法 (CTAB，hexadecyltrimethylammonium bromide，十六燒基三甲基溴化按，是一種陽離子去 汙劑，具有從低離子強度溶液中沉澱核酸與酸性多聚糖的特性。）提取蘋果葉總RNA，以反 轉錄得到的cDNA為模板，用一對帶有酶切位點的引物R) 1和RO1進行PCR擴增，用1. 0 %瓊 脂糖凝膠電泳檢測，在紫外光下割取目的基因條帶，採用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行 PCR產物回收，將膠回收產物連接到pMD18-T載體，熱激法轉化感受態的大腸桿菌DH5 α，用 藍白斑法篩選重組子，重組質粒提取採用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒，重組質粒 雙酶切鑑定陽性克隆，測序。克隆得到的蘋果根皮苷糖基轉移酶基因序列全長1452個鹼基 對，該基因編碼483個胺基酸。
[0045] 本發明所提供的表達載體的構建技術方案是：用BamH I和Hind III將得到的蘋 果根皮苷糖基轉移酶基因進行雙酶切，用T4連接酶與同樣用BamH I和Hind III雙酶切的 pET-32a(+)質粒連接。
[0046] 本發明提供的含有蘋果根皮苷糖基轉移酶基因的重組菌株的技術方案是：用 轉化到DH5 α後所提的陽性重組質粒pET-32a-p2' GT熱激法轉化到感受態的大腸桿菌 BL21(DE3)中。
[0047] 本發明提供的重組根皮苷糖基轉移酶製備技術方案是：將含有重組質粒的菌 體進行異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)誘導表達，異源表達產物通過飽和硫酸銨 沉澱、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephadex-75凝膠過濾色譜純化，採用腸激酶 (Enterokinase)切除載體標籤蛋白，獲得重組根皮苷糖基轉移酶。
[0048] 1、基因擴增
[0049] 引物：
[0050] FOl (5' -ACGGGATCC ATG GGA GAC GTC ATT GTA CTG-3'）（劃線部分為BamH I 酶切 位點）；
[0051] ROl (5, -CCCAAGCTT TTA TGT AAT GCT ACT AAC AAA GTT G-3'）（劃線部分為 Hind III酶切位點）。
[0052] 以反轉錄得到的cDNA為模板，用FOl和ROl兩個引物進行PCR擴增，Takara Premix Taq試劑盒，PCR反應體系如表1 :
[0053] 表I PCR反應體系
[0054]
【權利要求】
1. 一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶，其特徵在於，該糖基轉移酶具有如SEQ. ID. NO. 1 所示的胺基酸序列。
2. 根據權利要求1所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶，其特徵在於，編碼所述重 組蘋果根皮苷糖基轉移酶的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3. -種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的分離純化方法，其特徵在於，包括以下步驟： 1) 採用CTAB法提取蘋果葉總RNA，以反轉錄得到的cDNA為模板，用一對帶有酶切位點 的引物F01和R01進行PCR擴增，經檢測後獲取目的基因條帶，對PCR產物進行回收； 2) 將步驟1)得到的PCR產物連接到pMD18-T載體上，採用熱激法轉化感受態細胞後， 篩選重組子，得到重組質粒； 3) 對重組質粒雙酶切鑑定陽性克隆、測序，得到重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的基因序 列； 4) 對含有重組質粒的菌體進行異丙基-e -D-硫代半乳糖苷誘導表達，異源表達產物 通過飽和硫酸按沉澱、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephadex-75凝膠過濾色譜純 化，再經腸激酶切除載體標籤蛋白，獲得純化後的重組根皮苷糖基轉移酶。
4. 根據權利要求3所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的分離純化方法，其特徵在 於，步驟1)所述的引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，引物R01的核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 4所示；酶切所用的酶為BamH I和Hind III。
5. 根據權利要求3所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的分離純化方法，其特徵在 於，所述的感受態細胞為大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞。
6. 根據權利要求3所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的分離純化方法，其特徵在 於，所述熱激法轉化感受態細胞的具體操作為： ① 將重組質粒轉移至裝有感受態細胞的離心管中，輕輕混勻； ② 冰浴30min後，在42°C熱激90s，冰浴3min ; ③ 加入無抗生素的LB液體培養基，在37 °C下振蕩培養lh?3h ; ④ 復甦後的菌液離心，吸取上清液，對留在離心管底部的菌液用移液槍吹打重懸； ⑤ 用移液槍將重懸菌液移入帶有Amp抗生素且在37°C保溫的LB固體培養基平板上，用 滅菌的塗布器塗布均勻； ⑥ 將平板倒置於37°C恆溫箱中培養12?16h。
7. 根據權利要求3所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的分離純化方法，其特徵在 於，所述對含有重組質粒的菌體進行異丙基_ 0-D-硫代半乳糖苷誘導表達具體操作為： 挑取含有重組質粒的單菌落接種於帶有Amp抗生素的液體LB培養基中，在37°C， 200prm下振蕩培養過夜，再按1 %的體積比接種到帶有Amp抗生素的新鮮LB培養基中， 在37°C，180rpm下，振蕩培養至0D600達0. 6?1. 0 ;加入異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷， 在20°C下誘導4h ;經離心收集菌體，菌體用生理鹽水洗滌，再加入細胞緩衝液，進行超聲破 碎，然後在4°C，12000rpm下離心lOmin，得到粗酶液I。
8. 根據權利要求7所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的分離純化方法，其特徵在 於，所述飽和硫酸銨沉澱具體操作為： 冰浴下，向粗酶液I中加入（NH4)2S04粉末至（NH4) 2S04終質量濃度為30%，攪拌均勻後 離心，取上清液，繼續加入（NH4)2S04粉末至（NH4) 2S04終質量濃度為70%，攪拌均勻後，4°C 靜置lh，然後離心取沉澱；將沉澱用緩衝液溶解後用30kDa超濾離心管進行酶液的濃縮和 脫鹽，得到粗酶液II。
9. 根據權利要求8所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的分離純化方法，其特徵在 於，所述DEAE-Sepharose陰離子交換層析的具體操作為： 將粗酶液II過0. 22 y m的濾膜，然後採用AKTA蛋白純化系統，用NaCl以lmL/min進 行線性洗脫，檢測各個洗脫峰的糖基轉移酶酶活，將有酶活的部分進行合併收集，轉入透析 袋，用PEG20000在4°C進行濃縮，得到酶液III。
10. 根據權利要求9所述的一種重組蘋果根皮苷糖基轉移酶的分離純化方法，其特徵 在於，所述Sephadex-75凝膠過濾色譜純化具體操作為： 將酶液III注射到AKTA蛋白純化系統，使用Sephadex-75凝膠柱進行純化，用緩衝液以 lmL/min流速進行洗脫，檢測各個洗脫峰的糖基轉移酶酶活，合併收集有酶活的部分，轉入 透析袋用PEG20000在4°C進行濃縮。
【文檔編號】C12R1/19GK104480080SQ201410675756
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月21日 優先權日:2014年11月21日
【發明者】樊明濤, 徐穎, 張庭靜 申請人:西北農林科技大學