一種人胱抑素c的磁微粒分離化學發光免疫分析檢測方法

2023-07-21 19:12:31 5

專利名稱：一種人胱抑素c的磁微粒分離化學發光免疫分析檢測方法
技術領域：
本發明屬於免疫檢測分析技術領域，涉及到臨床上評價腎功能的一項診斷指標胱 抑素C，提供了一種人胱抑素C的磁分離化學發光免疫檢測方法，適用於人血清、血漿或尿 液中胱抑素C的定量檢測。
背景技術：
胱抑素C(Cystatin C)是半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族中的一員，是一種非糖基化 的鹼性蛋白質，相對分子質量為13.3950 等電點為8.0 9.5，由122個胺基酸組成。胱 抑素C編碼基因位於人類第20號染色體，具有與「看家基因」的啟動子區相同的特徵，因此 胱抑素基因被視為「看家基因」。胱抑素C廣泛存在於植物、動物及原蟲中，由有核細胞以恆 定的速率產生，在人體大部分組織中穩定表達，存在於各種體液中，在腦脊液和精液中濃度 最高，尿液中最低，其生理功能是調節半胱氨酸蛋白酶的活性，在細胞內肽類和蛋白質的代 謝中起重要作用，特別是在膠原代謝中，能使一些前激素的蛋白水解，釋放於靶組織中發揮 各自的生物學作用。胱抑素C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的簡稱，以前也被稱作Y-痕跡 蛋白(Y -traceprotein)或 Y-後球蛋白(post-γ-globulin)。胱抑素C在臨床上被視為監測腎功能的一項高靈敏度，高特異性的指標。胱抑素 C因其低相對分子質量，且在生理PH環境中帶正電荷，故可自由通過腎小球濾過膜，在近曲 小管幾乎完全被重吸收並降解，不再回到血循環中。血清胱抑素C被認為是比肌酐、尿素氮 等更理想、更靈敏的測定腎小球濾過率的內源性指標；尿胱抑素C水平可反映腎小管功能； 另外胱抑素C在腎衰竭、腎移植、糖尿病腎病、高血壓腎病等繼發性腎病的早期檢測及預後 監測中也有應用。目前臨床檢驗用胱抑素C試劑盒主要是採用免疫比濁法，與酶聯免疫法、免疫熒 光技術、化學發光免疫等分析技術相比其靈敏度、精密度和特異性明顯較差。本發明所採用 的磁微粒分離化學發光免疫檢測方法是酶標記技術、磁分離技術和化學發光檢測技術的結 合，酶促底物發光的專一性高、反應高效、反應條件溫和、發光值穩定且受外界條件影響較 小；磁分離技術中採用的0. 01-5 μ m磁性微粒子作為載體，免疫反應在準液相條件下進行 並通過外加磁場對免疫複合物與未反應物進行分離，使得免疫反應和分離快速而徹底，相 對於固相載體其靈敏度、特異性好和精度都得到了很大提高。

發明內容
本發明的目的在於提供一種具有靈敏度高、特異性好、適用性廣的檢測人胱抑素C 的磁微粒分離化學發光免疫檢測方法。本發明生成的胱抑素C磁微粒分離化學發光免疫的試劑盒組成包括①胱抑素C 校準品(含一系列濃度的胱抑素C，用於建立標準曲線)；②胱抑素C質控品(由人血清配 制而成，含一定濃度胱抑素C)；③胱抑素C稀釋液(用於稀釋高濃度樣本)；④胱抑素C抗 試劑(偶聯有生物酶的胱抑素C抗體和偶聯有FITC的胱抑素C抗體的混合溶液)；⑤磁分離試劑(結合抗FITC的磁微粒混懸液)⑥清洗液濃縮液(用於配製清洗液)；⑦底物溶 液(生物酶催化的發光底物)。所述的胱抑素C磁微粒分離化學發光免疫檢測方法的檢測步驟如下(1)加樣與免疫反應在試管中加入5-100 μ L處理好的樣本和質控品，然後加入 10-500 μ L胱抑素C抗試劑，混勻，37°C溫育5-60分鐘；(2)免疫複合物與磁微粒結合向試管中加入20-100 μ L磁分離試劑，混勻，37°C 溫育0-30分鐘(也可不溫育)；(3)磁分離與洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清；加入100-600 μ L清洗液， 去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然後再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清；可再次加 入洗液清洗一次(也可省去)；(4)加底物溶液並讀出樣本濃度每管加入50-300 μ L生物酶催化的發光底物，酶 促底物發光，根據樣本的發光值從標準曲線上讀出樣本中胱抑素C含量。所述的胱抑素C磁微粒分離化學發光免疫檢測方法的工作原理是首先，待檢樣 本與酶標記抗體、FITC標記抗體特異性結合形成「三明治」結構的夾心複合物，夾心複合物 再與磁微粒特異性結合(通過抗體上偶聯的FITC與磁微粒上的抗FITC結合)；經過洗滌， 結合物通過外加磁場被留下，未結合的抗原、抗體和其他物質被去除；加入底物，用化學發 光分析儀檢測其發光值。在一定濃度範圍內，待測樣本中的胱抑素C濃度與發光值成正比， 最後通過用四參數擬合出的標準曲線計算出樣本的濃度。本發明的技術解決方案如下(1)磁分離試劑的製備將FITC抗體連接在磁微粒表面。所述的磁微粒直徑在 0.01-5.0μπι之間，具有超順磁性，表面含有氨基(ΝΗ2-)或羧基(C00H-)活性基團。所述的 FITC抗體與磁微粒可以通過化學交聯劑，如戊二醛、l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC)等以共價鍵的形式，也可以通過物理吸附(靜電作用、 離子鍵或疏水作用等)的形式進行偶聯。(2)胱抑素C抗試劑中酶標抗體的製備將生物酶與胱抑素C抗體偶聯， 所述的生物酶可以是辣根過氧化物酶(HRP)，也可以是鹼性磷酸酶(ALP)。偶聯 方法可以是過碘酸鈉氧化法、戊二醛法或Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、2-Iminothiolane · HCl (2IT)交聯等多種方法。(3)底物溶液所述的底物溶液可以是HRP催化的發光底物魯米諾(Luminol)，也 可以是ALP催化的發光底物AMPPD，CSPD和CSPD-Star等。(4)質控品選取經滅活的人血清，將其混合後用稀釋液按一定比例稀釋而成。


圖1為血清樣本的線性圖，圖2為尿液樣本的線性圖。
具體實施例方式實施例1 抗FITC抗原與表面氨基(C00H-)磁微粒偶聯，製備磁分離試劑取IOOmg表面含羧基(C00H-)活性基團的磁微粒用0. IM MES(2-[N-morpholino] ethane sulfonic acid)，pH 4. 5-5溶液10ml洗滌3次。磁微粒用該溶液Iml重懸，加入
42mg抗FITC抗體，混合均勻。加入100 μ 1 10mg/ml EDC溶液，混合均勻後室溫反應2小時。 用IOml含牛血清白蛋白(BSA)的0.0IM磷酸鹽緩衝液(PBS)pH7. 4洗滌磁珠3次後，用 該溶液配製成2. 5mg/ml的磁分離試劑工作液。實施例2 鹼性磷酸酶(ALP)與胱抑素C抗體的偶聯取5mg胱抑素C抗體，濃縮至5mg/ml，加入13. 76mg/mL的活化劑 2-Iminothiolane -HCl (2IT)溶液10 μ 1，室溫放置20分鐘後加甘氨酸終止活化反應，室溫 下放置5分鐘。使用PGlO柱子除鹽，收集洗脫蛋白。取 5mg ALP 溶液，力口 入 6. 69mg/mL 的 Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)溶液50 μ 1，室溫放置30分鐘，加入甘氨酸終止活化反 應，室溫放置5分鐘。使用PGlO柱子除鹽，收集洗脫蛋白。將收集的胱抑素C抗體與收集的ALP混合，4 °C反應20個小時，然後使用 Supperdex200凝膠層析柱分離純化，收集第二峰和第三峰即偶聯物，並將其保存於4°C。實施例3 檢測血清中胱抑素C含量用本試劑盒對500例體檢者血清進行檢測，其中男女各半，分析體檢人群中胱抑 素C的血清水平。材料與儀器(1)胱抑素C試劑盒；(2)化學發光免疫分析儀MAGLIA60 北京倍愛康生物技術有限公司生產；(3)磁分離器北京倍愛康生物技術有限公司生產；(4)水浴箱(用於37°C溫浴)。檢測步驟如下(1)加樣與免疫反應在試管中加入15 μ L處理好的樣本、和質控品，然後加入 90 μ L胱抑素C抗試劑，混勻，37 °C溫育30分鐘；(2)免疫複合物與磁微粒結合向試管中加入40 μ L磁分離試劑，混勻，37°C溫育5 分鐘；(3)磁分離與洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清；加入300 μ L清洗液，去 除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然後再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清。再次加入 300 μ L清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然後再次使磁微粒在磁場中沉降，去除 上清；(4)加底物溶液並讀出濃度每管加入200 μ L底物溶液，酶促底物發光，根據樣本 的發光值從標準曲線上讀出樣本中胱抑素C含量。檢測結果90%的人群(500例)血清水平為465. 352 1072. 231ng/ml，符合文獻報導。實施例4 本試劑盒的性能評價根據體外診斷試劑的特點，按慣例檢測本試劑盒的靈敏度、線性、準確性、精密度 和特異性。材料與儀器、檢測步驟同實施例3。檢測結果(1)靈敏度0. 001mg/L以下；免疫比濁法A(申請號=200810084390. X)靈敏度為 0. lmg/L，免疫比濁法B(申請號=200910090689. 0)靈敏度為0. 06mg/L (均按同一方法進行
5計算)；(2)線性；r2 = 0.9991 (將1例血清樣本用稀釋液分別按1/4、1/8、1/32、1/64、 1/256稀釋；將1例尿液樣本用稀釋液按1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64 ；用試劑盒檢 測稀釋後樣本，以稀釋比例和檢測濃度做回歸曲線，求出相關係數r的平方值，回歸曲線見 圖1、圖2)；(3)準確性通過加樣回收評價其準確性，即向樣本中添加已知量的胱抑素C的純 品，血清、尿液中加樣回收率在89% 110%，數據見表1 ；
添加前樣本值添加量添加後樣本值加樣回收率(％ )血清1632. 23970.291762. 33109.97血清1632. 231940.572439. 9694. 84血清2675. 33970.291686. 47102. 48血清2675. 331940.572649. 46101. 28尿液161. 03970.29918. 5089. 06尿液161. 031940.571860.9392. 97尿液253. 97970.291067. 64104. 24尿液253. 971940.571912. 9595. 91表1加樣回收實驗(加樣回收率=添加後樣本值/(添加前樣本值+添加量)*100， 濃度單位μ g/L) (4)精密度用兩批試劑盒測試同一例血清樣本，第一批批內變異係數為 1. 75%，第一批批內變異係數為2. 31% ；兩批批間變異係數為2. 08%。
權利要求
一種人胱抑素C磁微粒分離化學發光免疫檢測方法，其特徵在於結合了酶標記技術、磁微粒分離技術和化學發光檢測技術，並生成了檢測試劑盒。
2.根據權利要求1所述的酶標記技術，其特徵在於生物酶標記胱抑素C抗體的方法如下所述的生物酶可以是辣根過氧化物酶(HRP)，也可以是鹼性磷酸酶(ALP)。偶 聯方法可以是過碘酸鈉氧化法、戊二醛法或Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、2-Iminothiolane · HCl (2IT)交聯等多種方法。
3.根據權利要求1所述的磁分離技術，其特徵在於磁分離試劑的製備方法如下將FITC抗體連接在磁微粒表面。所述的磁微粒直徑在0. 01-5. 0 μ m之間，具有超 順磁性，表面含有氨基(NH2-)或羧基(C00H-)活性基團。所述的FITC抗體與磁微粒 可以通過化學交聯劑，如戊 二醛、l-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC)等以共價鍵的形式，也可以通過物理吸附(靜電作用、離子鍵或疏水 作用等)的形式進行偶聯。
4.根據權利要求1所述的化學發光發光檢測技術，其特徵在於化學發光所用的底物 溶液可以是HRP催化的發光底物魯米諾(Luminol)，也可以是ALP催化的發光底物AMPPD， CSPD 和 CSPD-Star 等。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於試劑盒中的質控品是選取經滅活的人血 清，將其混合後用稀釋液按一定比例稀釋而成。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於試劑盒中胱抑素C抗試劑包含偶聯有生 物酶的胱抑素C抗體和偶聯有FITC的胱抑素C抗體。
7.根據權利要求6所述的用於偶聯FITC的抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。
8.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於檢測步驟如下(1)加樣與免疫反應在試管中加入5-100μ L處理好的樣本、和質控品，然後加入 10-500 μ L胱抑素C抗試劑，混勻，37°C溫育5-60分鐘；(2)免疫複合物與磁微粒結合向試管中加入20-100μ L，0. l-10mg/mL磁分離試劑，混 勻，37°C溫育0-30分鐘(也可不溫育)；(3)磁分離與洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清；加入100-600μ L清洗液，去除 磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然後再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清；可再次加入洗 液清洗一次(也可省去)；(4)加底物溶液並讀出樣本濃度每管加入50-300μ L生物酶催化的發光底物，酶促底 物發光，根據樣本的發光值從標準曲線上讀出樣本中胱抑素C含量。
全文摘要
本發明提供了人胱抑素C的體外檢測方法，該方法採用了磁微粒分離化學發光免疫分析技術，它是酶標記技術、磁微粒分離技術和化學發光檢測技術相結合的產物，兼具靈敏度高、特異性好、重複性好等特點。可用於人血清、血漿和尿液中胱抑素C含量的測定，臨床上該指標多用於評價腎功能，主要用於監測腎小球濾過率、腎小管功能障礙和各類繼發性腎病。
文檔編號G01N33/535GK101937000SQ20101024589
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月5日 優先權日2010年8月5日
發明者仝文斌, 張雪蓮, 郭健夫, 魯衡 申請人:北京倍愛康生物技術有限公司